BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

N
N
G
G
H
H
I
I
Ê
Ê
N
N
N
ND
D
Ị
Ị
C
C
H
HĐ
Đ
Ố
Ố
I
IV
V
Ớ
Ớ
I
I
H
H
Ợ
Ợ
P
PM
M
B
B
P
P
-
-
V
V
T
T
2
2
e
e
B
BT
T

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8-2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
N
N
G
G
H
H
M
M
I
I
Ễ
Ễ
N
ND
D
Ị
Ị
C
C
H
HĐ
Đ
Ố
Ố
I
IT
T
Ổ
ỔH
H
Ợ
Ợ
P
PM
M
B
B
P
P
-
-
V
V
T
T
2
2

Giáo Viên Hướng Dẫn: Sinh Viên Thực Hiện:
TSKH NGUYỂN NGỌC HẢI PHAN LÊ MAI
PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8-2005

iii
LỜI CẢM ƠN

Con luôn nhớ ơn ba mẹ sinh thành, dưỡng dục và tạo mọi điều kiện cho con tự
hoàn thiện mình, cảm ơn sự quan tâm, động vịên của mọi người trong gia đình.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ
Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã
truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, người
Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá
luận.
Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang,

và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta.
Do vậy các nghiên cứu nhằm tạo ra vaccin phòng bệnh phù đầu trên heo đang nhận
được sự quan tâm rất lớn, mở ra nhiều triển vọng cho ngành chăn nuôi heo nước ta.
Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được
chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được
protein này. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn
dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ” nhằm xác định khả năng ứng
dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù đầu do E. coli gây ra trên heo .
Chúng tôi sử dụng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (kỹ thuật
Ouchterlony) để đánh giá sự xuất hiện của kháng thể và phản ứng trung hoà độc tố
VT2e trên môi trường tế bào vero để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố
verotoxin.
Những kết quả đạt được sau 7 tháng nghiên cứu:
- Cả hai quy trình gây miễn dịch dài ngày và ngắn ngày đều tạo kháng thể
kháng MBP-VT2eB có hiệu quả.
- Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứng đáp ứng miễn dịch trên thỏ
tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero.
- Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà
độc tố VT2e (gây bệnh phù đầu trên heo).
v
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. iii
TÓM TẮT ....................................................................................................................iv
MỤC LỤC .....................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................xi

trên môi trường tế bào vero....................................................................20
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ...............................21
3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................21
3.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................21
3.3. Vật liệu và hoá chất........................................................................................21
3.3.1. Thú thí nghiệm .......................................................................................21
3.3.2. Vật liệu và hoá chất ................................................................................21
3.3.3. Môi trường ..............................................................................................22
3.3.4. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................22
3.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22
3.4.1. Bố trí thí nghiệm .....................................................................................22
3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm .................................................................................24
3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh ..................................................................24
3.4.4. Xử lý kháng huyết thanh ........................................................................24
3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S ........ 24
3.4.4.2. Hòa tan kháng thể ...................................................................25
3.5. Đánh giá .........................................................................................................27
3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật
Ouchterlony) .....................................................................................................27
3.5.2. Định lượng: phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường
tế bào vero ........................................................................................................ 28
3.5.2.1. Xác định liều TCID
50
(Tissue Culture Infectious Dose 50) .....28
3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố ................................................ 31

vii
3.6. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 33
3.7. Đánh giá kết quả và xử lý số liệu .................................................................33
PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................34

PHỤ LỤC ................................................................................................................56

viii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ag
ATCC

DAG
DMEM

TCID
50EDTA

FBS
Gb4
Ig
IL2
IL4
IL5
IL6
IP
3


Macrophage activating
factor
Maltose binding protein
Major histocompatibility
complex class II antigens
Macrophage inhibitation
factor
Manufacturer's working
cells bank
Polymerase chain reaction
Kháng nguyên
Tổ chức sưu tầm nhân
giống Mỹ

Huyết thanh bào thai bê

Globulin miễn dịch
Yếu tố có tác dụng hoạt


Phosphate buffer stalin
Shiga-like toxin
Cytotoxic T cell
Delayed type
hypersensitivity T cell
Inducer T cell
Helper T cell
Vervet Monkey Origin
Verotoxin
SLT-II variant
VT2e subunit B
Tế bào lympho T gây độc
Tế bào lympho T gây quá
mẫn muộn
Tế bào lympho T cảm ứng
Tế bào lympho T giúp Độc tố Shiga-like toxin IIv
Tiểu đơn vị B của VT2e

Hình 2.8: Hình 3.1:
Hình 3.2:
Hình 4.1:

Hình 4.2:

Hình 4.3:

Hình 4.4:

Hình 4.5: Hình 4.6:
Cấu trúc kháng thể ................................................................................5
Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được
phản ảnh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh ...................7
Quá trình biệt hoá và phân chia của tế bào lympho B ........................11
Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề
mặt tế bào lympho B............................................................................12
Sự kết hợp giữa tế bào lympho T
H
và tế bào lympho B......................13
Tế bào lympho B xử lý và trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho
T
H
........................................................................................................13

Hình 4.11:

Hình 4.12:

PHỤ LỤC
Hình 1:
Hình 2:
Hình 3:
Hình 4:
Hình 5:
Hình 6:
lại 1) ....................................................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (mũi nhắc
lại 1) ....................................................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc
lại 2) ....................................................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................38
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây miễn
dịch ......................................................................................................40

Tế bào vero .........................................................................................60
Tế bào vero chịu tác động của độc tố VT2e .......................................60
Thú thí nghiệm ....................................................................................61
Tiêm protein MBP-VT2eB cho thỏ ....................................................61
Lấy máu tĩnh mạch tai thỏ ..................................................................62

mẫu nuôi cấy tế bào với dịch độc tố VT2e ................41
Kết quả đo OD
620
của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) .........45
Kết quả đo OD
620
của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại
4) .............................................................................................................47
Kết quả đo OD
620
của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) ..................................48
Kết quả đo OD
620
của mẫu thỏ 2 ............................................................50
Kết quả phản ứng trung hoà độc tố của hai quy trình gây miễn dịch .....52

xiv

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1:
Biểu đồ 4.2:

Biểu đồ 4.3:

Biểu đồ 4.4:

Biểu đồ 4.5:
Đồ thị chuẩn độ độc tố VT2e ............................................................42
Đồ thị trung hòa độc tố VT2e của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi
nhắc lại 3) trên môi trường tế bào vero .............................................46

đòi hỏi phải tiêm lập lại nhiều lần, vì tính gây đáp ứng miễ
n dịch không cao.
Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra
được chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch
được protein này. Từ thực tế đó, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học,
với sự hướng dẫn của TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, PGS-TS khoa học Nguyễn Lê
Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch
đối với protein
tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ”.
1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1. Mục tiêu
Đánh giá hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB
trên thỏ nhằm xác định khả năng ứng dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù
do E. coli gây ra trên heo.
2

1.2.2. Yêu cầu
 Thu nhận kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.
 Xác định sự hiện diện của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.
 Thử khả năng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero.


Kháng thể được gọi là globulin miễn dịch (Immunoglobulin, Ig), ở động vật hữu
nhũ có 5 lớp Ig: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, các Ig đều là protein hình cầu. Mỗi phân tử
Ig đều có hai cặp chuỗi polypeptide nặng ký hiệu là chuỗi H (heavy chain) và hai
chuỗi nhẹ ký hiệu là L (light chain). Sự khác biệt chủ yếu giữa hai lớp Ig với nhau là ở
chuỗi nặng. Các chuỗi H hoặc L trên cùng một phân tử kháng thể bao giờ cũng giống
nhau hoàn toàn từng đôi một.
4

2.2.1. Chuỗi nhẹ (L)
Chuỗi nhẹ có trọng lượng khoảng 22.000, có thể phân biệt hai type chuỗi nhẹ khác
nhau, đó là type kappa (κ) và type lambda (λ). Hai chuỗi này có tính kháng nguyên
khác nhau hoàn toàn.
Mỗi chuỗi nhẹ có 214 acid amin. Thứ tự các acid amin từ 108 – 214 là hoàn toàn
không thay đổi. Còn các acid amin từ số 1 – 107 có thể thay đổi về thứ tự. Đoạn này
được gọi là vùng thay đổi VL (variable light), trong vùng thay đổi có đoạn thay đổi
mạnh nhất gọi là vùng siêu biến (hypervariable regions). Những đoạn siêu biến trong
chuỗ
i lambda là các đoạn từ vị trí acid amin 24 – 34, 50 – 56 và 89 – 97.
2.2.2. Chuỗi nặng (H)
Chuỗi nặng có trọng lượng phân tử khoảng 50.000, gồm 446 acid amin được chia
làm hai phần: vùng thay đổi VH (variable heavy) và vùng hằng định CH (constant
heavy).
Người ta phân biệt 5 lớp Ig chủ yếu dựa vào sự khác nhau của các mạch
polypeptide trong chuỗi nặng. Nếu trong chuỗi nặng của Ig có các chuỗi:
- Gamma (γ) thì Ig đó được gọi là IgG.
- Muy (µ) thì Ig đó được gọi là IgM.
- Alpha (α) thì Ig đó được gọ
i là IgA.
- Delta (δ) thì Ig đó được gọi là IgD.
- Epsilon (ε) thì Ig đó được gọi là IgE.

I
bị kích thích và tiết
ra các yếu tố có tác dụng hoạt hoá đại thực bào MAF (macrophage activating factor),
đến lượt đại thực bào được hoạt hoá và tiết ra interleukin 1. Interleukin 1 sẽ tác động
trở lại lympho T
I
. Lúc này, lympho T
I
có đủ hai tín hiệu kích thích: một là quyết định
kháng nguyên đặc hiệu, hai là interleukin 1, đó là hai tín hiệu cần và đủ để hoạt hoá
lympho T
I
. Lympho T
I
sau khi được hoạt hoá sẽ tăng sinh và tiết ra interleukin 2,
interleukin 2 sẽ tác động lên một loạt các tế bào khác, trước hết là một loạt các tế bào
cùng đến nhận diện các quyết định kháng nguyên được trình diện trên bề mặt đại thực
bào như tế bào lympho T giúp (helper T cell, T
H
), lympho T gây quá mẫn muộn
(delayed type hypersensitivity T cell, T
DTH
). Các tế bào này sau khi nhận được các
quyết định kháng nguyên thì sẽ xuất hiện các thụ thể để tiếp nhận kích thích của
interleukin 2. Hai tín hiệu cần và đủ giúp chúng hoạt hoá và phát huy tác dụng.
Hình 2.1: Cấu trúc kháng thể
6

Các lympho T
DTH

mẫn cảm.
2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo
Khi kháng nguyên vào cơ thể lần hai, kháng nguyên gặp ngay tế bào lympho T
đã mẫn cảm, tức là đã có những thụ thể (receptor) kiểu kháng thể ở trên bề mặt và sự
kết hợp như kháng nguyên – kháng thể tạ
o nên kích thích để chúng tiết ra các
lymphokin trong đó có MIF, MAF làm tế bào đại thực bào đứng tại chỗ, tăng cường
hoạt động nuốt và tiêu hoá kháng nguyên. Mặt khác, các đại thực bào lại tiết ra
interleukin 1 để kích thích lympho T
I
tăng tiết interleukin 2, cơ chế hoạt động cũng
tương tự lần 1, nhưng có hai điểm khác biệt:
- Mức độ phản ứng do có nhiều tế bào đã mẫn cảm nên mạnh mẽ hơn nhiều.
- Phản ứng khởi phát là sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể.
7
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch
- Tính lạ của kháng nguyên
Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao là sự
khác biệt chủng loài giữa thú được gây miễn dịch và kháng nguyên. Trong miễn
dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với cơ thể thú bao nhiêu thì khả năng sinh
miễn dịch càng cao bấy nhiêu. Ví dụ: Albumin gà sẽ tạo kháng thể cao hơn
albumin bò khi cùng tiêm cho dê. Trong miễn d
ịch qua trung gian tế bào chỉ
cần sự khác biệt giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao, ví dụ như

- Cách gây miễn dịch và liều lượng của kháng nguyên
Ngoài các y
ếu tố trên, còn có những các yếu tố khác ảnh hưởng đến tính
sinh miễn dịch:
• Đường đưa kháng nguyên vào cơ thể vật chủ: với những kháng nguyên
mạnh, đưa kháng nguyên vào đường mạch máu có thể dễ dàng gây đáp
ứng miễn dịch, ví dụ: virus, vi khuẩn, tế bào. Nhưng với những kháng
nguyên hoà tan thì phải có quy trình gây miễn dịch thích hợp, tốt nhất là
đường tiêm trong da, dưới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần.
• Liề
u lượng kháng nguyên: Nếu lượng kháng nguyên quá ít thì không đủ
gây đáp ứng miễn dịch. Ngược lại, nếu lượng kháng nguyên nhiều quá sẽ
gây ức chế miễn dịch.
• Quy trình gây miễn dịch cũng ảnh hưởng lớn đến tính sinh miễn dịch của
phân tử kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên, gây miễn dịch trên
hai lô thú thí nghiệm thuần chủng nhưng ở hai quy trình gây miễn dịch
khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. Mỗi loạ
i kháng
nguyên thích hợp với một loại quy trình gây miễn dịch riêng. Với những
kháng nguyên yếu thường phải được gây miễn dịch bằng quy trình hết
sức nghiêm ngặt và gây miễn dịch nhiều lần thì mới có đáp ứng miễn
9

dịch mạnh. Trong khi đó, với những kháng nguyên mạnh có khi chỉ cần
gây miễn dịch một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch mạnh.
- Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên
Nếu cùng một lúc gây miễn dịch nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì
kháng thể đặc hiệu được sinh ra tương ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất
ngang bằng hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình. Hiện
tượ

10

- Khả năng đáp ứng của thú
Ngày nay, người ta biết rằng với cùng một loại kháng nguyên, nếu đưa vào
các cơ thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau.
Tính sinh miễn dịch = tính kháng nguyên + khả năng đáp ứng miễn dịch của vật
chủ
Khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ phụ thuộc vào tính di truyền.

2.4. CƠ CHẾ MIỄN D
ỊCH DỊCH THỂ
[13]

Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể là do tế bào lympho B đảm nhận. Đầu tiên,
các tế bào nguồn (trong tủy xương) biệt hoá thành tế bào lympho B khởi thuỷ (pro-B).
Sau đó chúng tiếp tục biệt hoá thành tiền tế bào lympho B (pre-B), các tế bào này có
đặc điểm là chưa có Immunoglobulin (Ig) bề mặt mà chỉ có IgM trong bào tương
CIgM (cytoplasma IgM). Các phân tử Ig bề mặt hoạt động như các thụ thể tiếp nhận
kháng nguyên, là những protein tham gia cấu tạo màng tế bào. Các tiề
n tế bào lympho
B được biệt hoá thành các tế bào lympho chưa chín, các tế bào này đã có IgM bề mặt.
Sau đó, chúng tiếp tục biệt hoá thành các tế bào lympho B chín với sự xuất hiện của
IgM, IgD bề mặt (và một số nhỏ IgA và IgG bề mặt). Tuy nhiên, các tế bào lympho B
chín chưa phải là các tế bào sản xuất kháng thể. Nếu các tế bào lympho B chín không
gặp đuợc kháng nguyên thì chúng sẽ bị phân huỷ. Nếu tế bào lympho B chín gặp được
kháng nguyên cộng thêm sự h
ợp tác hỗ trợ của các tế bào lympho T
H
, chúng sẽ tiếp tục
biệt hoá thành các tế bào plasma (plasma cell) và tế bào ghi nhớ (memory cell).