TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
--------

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN 2011

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG
QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN

CƠ QUAN QUẢN LÝ: TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

Đà Lạt, tháng 05 năm 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
--------

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN 2011

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG
QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN

Cơ quan chủ trì
: Trường Đại học Đà Lạt
Chủ nhiệm đề tài
: Đỗ Bá Dương
Lớp CSK32 – MSSV: 0810951
Thành viên tham gia – Lớp CSK32:
Mã Phước Huyền Thanh An
Đặng Ngọc Nam


GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, nhóm chúng tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến:
 Ban Giám hiệu Trường Đại học Đà Lạt, Khoa Sinh học tạo mọi điều kiện cho
nhóm chúng tôi có cơ hội học tập và thực hiện đề tài này.
 Tất cả thầy cô đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi trong suốt những
năm học vừa qua.
 ThS. Nguyễn Khoa Trưởng, giảng viên Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Đà Lạt
đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
 Cảm ơn gia đình, anh chị khóa trước, bạn bè đã giúp đỡ, động viên chúng tôi.

Xin chân thành cảm ơn

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng nấm men phân
lập
từ
quả

Bảng 3.4. Khả năng đồng hóa lên men đường saccharose và đường glucose của
các

chủng

giống

đã

phân

lập

..... 22
Bảng 3.5. Số lượng tế bào nấm men sau khi nuôi cấy trong khoảng thời gian
từ

0h

–

48h

..... 23

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32


Cơ sở lý thuyết quá trình lên men rượu...............................................................4

1.3.

Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên...................................5

1.4.

Tổng quan nấm men............................................................................................7

1.4.1.

Hình thái và kích thước.......................................................................................7

1.4.2.

Cấu tạo của tế bào nấm men................................................................................7

1.4.3.

Sinh sản của nấm men.........................................................................................9

1.4.3.1. Sinh sản vô tính...................................................................................................9
1.4.3.2. Sinh sản hữu tính.................................................................................................9
1.4.4.

Các enzyme của nấm men.................................................................................10

1.4.5.


2.2.2.

Hóa chất............................................................................................................13

2.2.3.

Phương pháp phân lập nấm men.......................................................................13

2.2.4.

Phương pháp nhân giống...................................................................................15

2.2.5.

Phương pháp tạo bánh men rượu.......................................................................15

2.2.6.

Phương pháp lên men rượu...............................................................................16

2.2.7.

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men.....16

2.2.8.

Phương pháp xác định độ cồn...........................................................................17

2.2.9.



3.2.2.

Khả năng đồng hóa và lên men các nguồn đường của nấm men.......................22

3.3.

Đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men đã tuyển chọn được.............23

3.4.

Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu cần.............................................................25

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................27
Kết luận .......................................................................................................................... 27
Kiến nghị.......................................................................................................................... 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................28
PHỤ LỤC........................................................................................................................ 29
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32



Page 1


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về rượu cần

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều sản phẩm rượu khác nhau. Mỗi quốc gia đều có
những sản phẩm rượu đặc trưng, Nhật Bản có rượu sake, Hàn Quốc có Soju… Rượu
phương đông với nôi văn hóa lớn như Trung Quốc, Ấn độ, Đông Nam Á hầu hết được
sản xuất từ nguồn lương thực như các loại ngũ cốc.
Rượu vang là sản phẩm nổi tiếng gắn liền với nét văn hóa phương tây thường lên
men không qua chưng cất từ các loại trái cây mà đặc trưng là nho, Đây là sản phẩm nổi
tiếng của Pháp, Ý. Ngoài ra ở phương tây còn có một số sản phẩm truyền thống nổi tiếng
như: Mezcal (Tequila) của Mexico được làm từ cây Maguey (từ một loài xương rồng) đặc
trưng cho Mexico, rượu Whisky là nước uống của nhà tu Ireland.
Trên thế giới hiện không ngừng gia tăng về chủng loại rượu, số lương, chất lượng
rượu. Vì vậy việc giữ gìn và phát triển sản phẩm rượu cần truyền thống của Việt Nam
đóng vai trò quan trọng trong việc đa dạng hóa sản phẩm rượu trên thế giới.
Bên cạnh cây lúa nước là đặc trưng của Việt Nam thì sản phẩm rượu cần cũng được
nhiều người, nhiều quốc gia biết đến như là sản phẩm truyền thống thứ hai của dân tộc
Việt Nam.
Rượu cần là cách gọi của người Việt đối với loại rượu đặc sản được một số dân tộc
thiểu số Việt Nam ủ men trong hũ/bình/ché/chóe/ghè, không qua chưng cất, khi đem ra

- Hai chủng nấm mốc thuộc chi Mucor và Rhizopus. Hai chủng này có khả năng
đường hóa
- Hai chủng nấm men (chưa định danh), một trong hai chủng này vừa có khả năng
đường hóa, vừa có khả năng rượu hóa.
Một số chủng vi sinh vật tạp nhiễm khác (chưa định danh) và chưa rõ chức năng.
Với cách làm bánh men của người K ’Ho nói trên ta thấy thành phần vi sinh vật trong
bánh men là không ổn định. Do vậy ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng rượu được tạo
thành. Trong quá trình sản xuất rượu cần, việc dùng bánh men là còn phụ thuộc vào mùa.
Trong năm có mùa thích hợp cho sự thu hái của cây để làm men lá, có mùa không thu hái
được vì chúng không mọc. Vì vậy, không chủ động được nguồn men lá nên dần thay thế
bằng men nhân tạo (Nguyễn Thị Kim Huệ, 1996, Trần Thị Thanh, 2003).
Hiện nay, rượu cần đã được thương phẩm hóa từ lâu với một số hãng sản xuất rượu
cần nổi tiếng như: Rượu cần Y Miên, Rượu cần Y Pao, Rượu cần Hòa Bình. Nhưng thực
tế, trước thời buổi kinh tế thị trường, rượu cần dã bị thay đổi bản chất thực của men lá.
Hiện nay các nơi sản xuất rượu cần không sử dụng cây tự nhiên mà sử dụng men công
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN

Page 3


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

nghiệp hoặc men thuốc bắc để thay thế làm mất đi hương vị và làm giảm chất lượng sản
phẩm. Quá trình làm rượu diễn ra nhanh nhưng rượu không ngon, không đậm đà và có vị
chua nhiều. Trong khi đó, rượu cần truyền thống có vị ngọt, độ cồn nhẹ, giàu dinh dưỡng,
không gây phản ứng phụ.
Như vậy, với nguồn tài nguyên thực vật làm rượu cần phong phú, kinh nghiệm sản
xuất rượu lâu đời của đồng bào dân tộc Tây nguyên và nhu cầu sử dụng rượu ngày càng


Biến đổi phosphodioxy-acetone thành 2- phospho glycerate rồi thành axit
pyruvic.

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN

Page 4


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng



Axit pyruvic bị loại 1 phân tử CO2 để thành acetaldehyde.



Hình thành etanol do acetaldehyde lấy hydro từ NADH.

1.3. Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên
Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên là nấm men, nấm mốc có
sẵn từ các bánh men. Vì vậy bánh men có tính địa phương và không thuần khiết, nhưng
nói chung hệ vi sinh vật ở đây thường là:
 Nấm mốc gồm có Aspergillus oryzae, A. flavus, A. awamorii, A. usami, A. niger
(giống Aspergillus chiếm phần lớn), Mucor (M. Circinilloides), Rhizopus, Penicillium và
Amylomyces rouxii... Nấm mốc sinh enzyme amylaza đường hóa tinh bột.
 Nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae. Ngoài ra còn thấy có
Hyphopichia burtonii, Pichia anomada, Candida...những men này coi như là men dại,

vàng.
Aspergillus niger, bào tử thương đối lớn và rất đen, được gọi là mốc đen, có khả
năng sinh ra nhiều enzyme amylaza, nhưng đồng thời có thể tạo ra acid citric từ dịch
đường. Vì vậy người ta cũng không mong muốn sự có mặt của mốc này trong bánh men,
nhưng đây là một điều khó khăn vì mốc này rất phổ biến trong tự nhiên.
Việc sử dụng mốc vàng hoa cau trong nghề làm tương, nước chấm xì dầu và trong
nghề làm rượu cũng cần lưu ý: A. flavus có khả năng sinh enzyme amylaza và proteaza
dùng để thủy phân tinh bột thành đường, thủy phân protein thành peptide và acid amin,
nó còn sinh ra độc tố aflatoxin khi môi trường nuôi cấy có chất béo. Độc tố này ảnh
hưởng nhiều tới gan.
Mucor và Rhizopus có hình dạng rất giống nhau, chỉ khác nhau phần hệ sợi cơ chất.
Trong nghề làm rượu rất gặp hai giống này, đặc biệt là Mucor rouxii, M. mucedo, M.
japanicus. ở nước ta hay gặp M. rouxii (phát triển tốt trên môi trường czapek và trên
gạo).
Một số chủng Mucor có khả năng sinh tổng hợp hai hệ enzyme diastaza (amylaza)
đường hóa tinh bột và zymaza lên men rượu từ đường. Vì vậy chúng có thể lên men trực
tiếp từ tinh bột thành rượu. Mucor rouxii sinh ra nhiều rượu hơn một số loài khác và được
dùng nhiều trong men rượu.
Hơn nữa khi có mặt Rhizopus và Mucor lên men rượu có mùi thơm rất dễ chịu. Cơ
chế của mùi thơm ở đây của hai mốc này như thế nào đến nay hoàn toàn chưa rõ.

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN

Page 6


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng




Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

 Màng nguyên sinh chất: màng nguyện sinh chất có chiều dày khoảng 7-8Mm,
cấu tạo chủ yếu là protein chứa 50% trọng lượng khô. Chức năng màng giống như màng
nguyên sinh chất của vi khuẩn. Thông qua màng nguyên sinh chất mà thực bào cũng như
thải bỏ các sản phẩm trao đổi chất.
 Tế bào chất: tế bào chất nấm men là hệ keo bán lỏng chứa các loại protein, axit
amin, ARN, glucid, lipid và các loại hạt nucleotid chứa 42% ARN và 50% protit, và các
loại hợp chất phân tử nhỏ, chứa các cơ quan con, các vật thể và các chất dự trữ khác.
 Ribosome: số lượng ribosome thay đổi tùy từng loại, tùy từng giai đoạn phát triển
và điều kiện nuôi cấy. Có 2 loại ribosome là loại 70S và 80S.
 Ty thể: là những ty thể hình cầu, hình que, hình sợi kích thước khoảng 0,2-1Mm.
Ty thể gồm 2 lớp là màng trong và màng ngoài. Màng trong có hình lượn sóng hay hình
răng lược. Để tăng thêm diện tích tiếp xúc, giữa hai màng có các hạt nhỏ gọi là hạt cơ
bản, bên trong ty thể là chất dịch hữu cơ. Màng ngoài của tế bào nấm men khác với màng
ty thể là màng ty thể có rất nhiều đơn vị, hình thái dạng nấm và mũ nấm có đường kính
khoảng 80-100A. Màng ngoài của ty thể có chứa các loại enzyme của chuỗi hô hấp,
enzyme phosphorin hóa, và trên đó cư trú một số men không có trong màng trong như
mono aminoxydaza, NAD-xytocrom, C-seductase.
Trong ty thể người ta tìm thấy tất cả các yếu tố của hệ thống tổng hợp protein. Người
ta tách ra từ cơ quan này các loại ribosome “VK”. Tức là những hạt ribosome 70s của
ribosome này cũng giống như ARN, thông tin của ty thể được tổng hợp dưới sự kiểm soát
của ADN ty thể. ADN của ty thể nấm men là ADN dạng vòng, có khối lượng phân tử là
50x60 Ra, gấp 5 lần so với động vật bậc cao. ADN ty thể nấm men chiếm 15-23% tổng
lượng ADN của toàn tế bào nấm men. Có một loại plasmid được phát hiện năm 1967 ở
nấm men Saccharomyces cerevisiae được gọi là YAC (nhiễm sắc thể nhân tạo). Ty thể

 Sinh sản bằng phương pháp nảy chồi
Phương pháp nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến của nấm men. Khi nấm men
trưởng thành sẽ nảy ra một chồi nhỏ, chồi sẽ lớn dần lên, một phần nhân của tế bào mẹ
được chuyển sang chồi sau đó tách ra một nhân mới rồi hình thành vách ngăn để ngăn
cách với tế bào mẹ hoặc đính trên tế bào mẹ và tiếp tục nảy sinh tế bào mới. Hình thành
sinh sản này xảy ra đối với tất cả nấm men.
Sinh sản bằng phân cắt: một số ít nấm men như Sporobolomyces sinh sản bằng
phương pháp cắt ngang như vi khuẩn, tế bào dài ra rồi sau đó sinh ra những vách ngăn
đặc biệt và phân cắt thành nhiều tế bào.


Sinh sản bằng bào tử

Bào tử đốt: ở chi Geotrichum.
Bào tử bắn: ở chi Sporobolomyces.
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN

Page 9


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

Bào tử áo: ở nấm Candida albicans.
1.4.3.2.

Sinh sản hữu tính

Tế bào nấm men có thể sinh sản bằng nang hay túi bào tử, trong mỗi túi có 2-4 hoặc 8

phẩm khác.

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN Page 10


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

Amylase thuộc nhóm enzyme hydrolase xúc tác thủy phân lên kết glucoside trong tinh
bột và các sản phẩm tạo thành mà người ta chia nhóm thủy phân tinh bột ra làm nhiều
loại, trong đó có ba loại enzyme phổ biến:




α-amylase (α-1,4glucan, 4-glucanhydrogenase)
β-amylase (α-1,4glucan maltohydrolase)
Gluco-amylase (γ-amylase)

Các enzyme khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng đối với liên kết glucoside và một số
tính chất khác. Tùy thuộc vào mục đích thành phần mà người ta có thể sử dụng các loại
enzyme khác nhau.
1.4.4. Những ứng dụng của nấm men
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có khả năng sinh trưởng và phát triển
nhanh, các đặc điểm sinh lý phù hợp với sản xuất công nghiệp. Trong tế bào nấm men
chứa hầu hết các sản phẩm cần cho sự sống (protein, glucide, lipid, enzyme và các
vitamine, các acid nucleid, các chất khoáng). Từ những đặc điểm trên nấm men có rất
nhiều vai trò và được ứng dụng rộng rãi trong tất cả các lĩnh vực của đời sống.
Nhiều loại nấm men được sử dụng rộng rãi để nấu rượu, bia, sản xuất cồn, glicerine


2.2.1. Dụng cụ và thiết bị
 Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri.
 Tủ cấy, que cấy, đèn cồn, dao cắt (loại nhỏ), kéo.
 Tủ ấm.
 Tủ sấy.
 Máy lắc ổn nhiệt.
 Nồi hấp autoclave.
 Nhiệt kế.
 Cân kỹ thuật.
 Máy đo pH, giấy quỳ tím.
 Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy báo,vòng thun.
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN Page 12


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

 Túi dựng mẫu.

2.2.2. Hóa chất
 Đường glucose
 Pepton
 KH2PO4
 MgSO4
 NaCl
 H2SO4
 Agar
 Thuốc nhuộm Xanh methylene

cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 290C.
Sau thời gian từ 24 – 72 giờ các khuẩn lạc đặc trưng xuất hiện trên mặt thạch. Sau đó
tiến hành tách các khuẩn lạc khác nhau cấy truyền sang đĩa thạch petri khác tạo giống
thuần chủng.
Giống thuần được cấy giữ giống trong thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh. Các thao
tác luôn được đảm bảo vô trùng.
2.2.3.3.

Phương pháp phân loại nấm men

Phân loại nấm men dựa theo các đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm tế bào và sinh hóa của
chủng giống. Sử dụng khóa phân loại nấm men đến giống của Kudriavtxev, 1954.
2.2.3.4.

Quan sát hình thái khuẩn lạc

Mô tả hình thái, kích thước, màu sắc, tính chất của khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa
phân lập.
2.2.3.5.

Quan sát hình thái tế bào, cách thức sinh sản của nấm men

Làm tiêu bản giọt ép với thuốc nhuộm Xanh methylene 0,1% , mẫu là chủng giống đã
phân lập được nuôi cấy trong môi trường Hansen lỏng sau khoảng thời gian 20 – 24 giờ.
Quan sát trên kính hiển vi.
2.2.3.6. Xác định bào tử của nấm men
a. Nuôi cấy tạo bào tử
Từ ống giống lỏng sau 24 giờ nuôi cấy, cấy giống trên môi trường thạch tạo bào tử.
Môi trường tạo bào tử nấm men (xem phần phụ lục).
Mẫu cấy được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 29 0C trong 2 ngày, sau đó đem sốc nhiệt ở

nghiêng cho vào trong bình tam giác nhân giống đã chuẩn bị, khuấy cho tan. Thao tác
được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Sau đó đem đi nuôi trong máy lắc ổn nhiệt ở điều
kiện nhiệt độ 290C, tốc độ lắc 100 vòng/ phút.
Tiến hành nuôi cấy trong 24 giờ.
2.2.5. Phương pháp tạo bánh men rượu
Nguyên liệu: Gạo lức, rễ cây ”đoòng”, rễ cây vấn vương, thân cây gối hạc.
Dụng cụ: Dao, cối giã, khay đựng.
Phương pháp:
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN Page 15


Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32

GVHD:ThS. Nguyễn Khoa Trưởng

Bước 1: Rễ cây ”đoòng”, rễ cây vấn vương, thân cây gối hạc được cạo vỏ, đập dập,
phơi khô.
Tất cả nguyên liệu được cho vào cối giã nhuyễn. Hỗn hợp này gọi là bột tạo men.
Bước 2: Gạo lức đem ngâm (khoảng 2 giờ), vớt, để ráo đem xay nhỏ. Bột tạo men,
các chủng nấm men đem trộn với bột gạo bằng nước nóng (70 0 – 800C). Sau đó vo thành
viên như quả trứng gà rồi bỏ lên khay đựng có lót một lớp trấu ở dưới (3 cm). Đậy lại ủ 2
ngày ở nhiệt độ 300C cho đến khi xuất hiện nấm mốc trắng đều trên men.
Bước 3: Viên men được đem hong khô ở nhiệt độ 370C trong thời gian 3 ngày.
2.2.6. Phương pháp lên men rượu
Nguyên liệu: Men rượu cần tự nhiên, một trong các loại ngũ cốc sau: gạo, ngô (bắp),
củ sắn được nấu chín.
Dụng cụ: Chóe rượu cần 4 lít, 6 lít, khay, nong, nia, trấu sạch.
Phương pháp:
Bước 1: Nguyên liệu nấu chín sau đó dỡ, tải ra nong, nia, khay để nguội tới khoảng
300C.