Đ
Đ
Ạ
Ạ
I
IH
H
Ọ
Ọ
C
CQ
Q
U
U
Ố
Ố
C
CG
G
I

I
N
N
H
H T
T
R
R
Ư
Ư
Ờ
Ờ
N
N
G

K
H
H
O
O
A
AT
T
P
P
.
.H
H
Ồ
ỒC
C
H
H
Í
Í



N
N
G
G
H
H
Ệ
ỆH
H
Ó
Ó
A
AH
H
Ọ
Ọ
C
CB
B
Ộ


S
S
I
I
N
N
H
HH
H
Ọ
Ọ
C
C

ĐỒ ÁN MÔN HỌC CHUYÊN NGÀNH

TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI

Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình, động viên và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án này.
 Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những
kiến thức quý báu có liên quan đến đề tài.
 Các bạ
n sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM –
đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc.

http://www.ebook.edu.vn iii TÓM TẮT NỘI DUNG

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ_ FISH (fluorescence in situ hydridization) ra
đời từ năm 1989 và đến nay được xem là công cụ mạnh nhất trong nghiên cứu của
nhiều ngành khoa học, nổi bật nhất là sinh thái học, môi trường học, chẩn đoán và
phát sinh loài. Bằng 5 bước xử lý cơ bản: chuẩn bị mẫu và đầu dò, cố định mẫu, lai,
rửa mẫu, quan sát ta có thể thu được các thông tin chính xác về hình thái, số lượng,
không gian phân bố hay thành phần môi trường củ
a đối tượng nghiên cứu. Trên thế
giới đã ứng dụng FISH trong nhiều lĩnh vực, trong tương lai FISH sẽ sử dụng để
tăng cường hiệu quả biểu hiện của nhiều công cụ nghiên cứu khác. Ở Việt Nam
những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán
các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển k
ỹ thuật này ở nước ta trong
tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh
vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển.

4.2. Kết quả âm tính ....................................................................................... 16
4.2.1. Số lượng
đầu dò quá ít .................................................................... 16
4.2.2. Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích ................... 17
4.2.3. Hàm lượng rRNA thấp ................................................................... 17

http://www.ebook.edu.vn v

4.2.4. Ảnh chụp bị mất màu ...................................................................... 18
4.3. Biện pháp khắc phục ............................................................................... 18
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT FISH ........................................ 19
5.1. Sự đa dạng của vi sinh vật ...................................................................... 19
5.2. Hệ vi sinh vật trong nước thải ................................................................ 22
5.3. Vi khuẩn cộng sinh ................................................................................. 23
5.4. FISH trong y học .................................................................................... 24
5.4.1. Các quần thể vi khuẩn phức tạp ...................................................... 24
5.4.2. Phát hiện mầm bệnh trong các mô cấy và d
ụng cụ vô trùng ........... 29
5.4.3. Nấm ................................................................................................ 30
5.4.4. Thuốc thú y ..................................................................................... 31
5.4.5. Các mầm bệnh ở thực vật ............................................................... 31
5.4.6. Phát hiện các mầm bệnh bằng phương pháp lai không sử dụng chất
huỳnh quang ................................................................................................ 32
CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CỦA FISH ................................... 33
6.1. Trên thế giới ............................................................................................ 33
6.2. Tại Việt Nam .......................................................................................... 36
CHƯƠNG 7. TỔNG KẾT ................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 40
Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dò tìm vi sinh vật bằng phương
pháp FISH ...........................................................................................................8
http://www.ebook.edu.vn vii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

ISH : In Situ Hybridization
FISH : Florescence In Situ Hybridization
rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid
DNA : Deoxyribonucleic Acid
PCR : Polymerase Chain Reaction
CCD : Charged Coupled Device
CLSM : Confocal Laser Scanning Microscope
TSA : Tyramid Signal AmplificationCHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
http://www.ebook.edu.vn 1

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦUViệc nhận biết sự có mặt của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên chủ yếu sử
dụng kỹ thuật nuôi cấy cổ điển bằng phương pháp cấy chuyền kết hợp với lựa chọn
môi trường đặc hiệu gặp khó khăn trong nghiên cứu các loài vi sinh vật có tốc độ
sinh trưởng chậm hoặc chưa phân lập. Một nhược điểm nữa là tốn nhiề
u thời gian

thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình
dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô
bệnh. Độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở
thành công cụ nghiên cứu hữu hiệu nhất.
Trên thế giới, FISH được sử dụng trong việc mô tả quần thể vi sinh vật trong
môi trường tự nhiên, nổi bật là hệ
vi sinh vật ở trầm tích biển Wadden [88], tại vịnh
hẹp ở Na-uy [115], sinh vật phù du ở sông hoặc biển [6,52,73,82], tuyết hồ trên núi
cao [155], trong đất [37] và trên bề mặt rễ thực vật [92]. FISH đặc biệt phổ biến
trong y học, ngoài mục đích xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các
bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, các bệnh lây qua đường máu, ung thư…) FISH
còn được sử dụng để chẩn đoán thườ
ng qui sự bất thường về cấu trúc và số lượng
nhiễm sắc thể (trước sinh và sau sinh) của thai nhi.
Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng
trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật
này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và
chẩn
đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển.
Nhận thức được vai trò, tầm quan trọng và triển vọng phát triển của FISH trong
nghiên cứu về thế giới vi sinh vật, tôi tiến hành đi vào tìm hiểu kỹ thuật này trong
khuôn khổ bài báo cáo đồ án môn học.
dần được thay thế bởi thuốc nhuộm huỳnh quang.
Năm 1989, DeLong lần đầu tiên sử dụng oligonucleotide được đánh dấu chất
huỳnh quang để dò tìm các vi sinh vật đơn bào. So với các đầu dò phóng xạ, đầu dò
huỳnh quang sử d
ụng an toàn hơn, ít gây hại đối với môi trường và sức khỏe con
người, kết quả thu được chính xác hơn và không cần phải thực hiện bước dò tìm (vì

CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU
http://www.ebook.edu.vn 4

nhìn thấy trực tiếp). Hơn thế nữa, các đầu dò huỳnh quang có thể được đánh dấu
với nhiều chất nhuộm, phát xạ tại những bước sóng khác nhau, vì vậy có thể dò tìm
một vài trình tự đích chỉ với một lần lai. Độ nhạy, sự chính xác và thời gian tiến
hành ngắn là những ưu điểm nổi trội của FISH, giúp nó ngày càng phổ biến và
được áp dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa họ
c nghiên cứu về vi sinh vật.
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
http://www.ebook.edu.vn 5

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH

3.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH

FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vi sinh vật
mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với
các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần
phá vỡ tế bào).

từng nuôi cấy đặc hiệu. Số lượng lớ
n các bản sao rRNA 16S trong mỗi lần sao
chép và trong các quá trình hoạt động trao đổi chất của tế bào luôn cung cấp đủ số
lượng các trình tự đích để hiển thị được các dòng tế bào cụ thể, ngay cả các
oligonucleotide chỉ gắn một nhãn huỳnh quang trong thí nghiệm FISH. Việc lựa
chọn vị trí trình tự đích và quá trình thiết kế đầu dò phải được tiến hành với sự thận
trọng cao nhất. Gần đây, các trình tự
đích khác như rRNA 23S [10,82,94,104,143],
rRNA 18S [83,86,87,133] và gần đây là mRNA cũng đã được xác định thành công
bởi thí nghiệm FISH.
Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng trong FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độ
nhạy và khả năng xâm nhập vào trong tế bào. Một đầu dò oligonucleotide điển hình
thì có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, được tạo ra bằng một thiết bị tổng hợp tự
động. Các đầu dò ngắn thì dễ dàng tiế
p cận được với trình tự đích, nhưng chúng lại
mang được ít các trình tự đánh dấu. Trong FISH, các trình tự đích thông dụng nhất
là rRNA 16S bởi vì chúng ổn định về mặt di truyền, cấu trúc được bán bảo tồn, và
số lượng các bản sao nhiều. Do đó, các đầu dò được lựa chọn thường là các
oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất
trong quá trình lai. Các đầu dò oligonucleotide huỳnh quang ngày nay đ
ã có một số
sản phẩm được thương mại hóa. Chúng có thể lưu trữ được ở -20
0
C trong tối
khoảng vài tháng.CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
http://www.ebook.edu.vn 7


Enzyme này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide
phosphate) thành dạng Dephosphoryl, thể này tạo ra màu huỳ
nh quang đỏ sáng khi
kết hợp với Fast Red TR. Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách thực hiện này
có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotide chỉ gắn nhãn
huỳnh quang duy nhất. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
http://www.ebook.edu.vn 8

được cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín
hiệu Tyramide” (TSA) (Hình 2d). Hệ thống TSA làm tăng cường độ tín hiệu lên
khoảng 10 – 20 lần. Tuy nhiên, số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi
một cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dò thông thường được đánh dấu duy nhất
một chất huỳnh quang. Điều này xảy ra là do quá trình xâm nhậ
p của các chất cao
phân tử vào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường.
Mặc dù enzyme lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu dò vào trong tế
bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường như
không áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương, do đó phương pháp này
chủ yếu được dùng để phân tích các quần thể vi khuẩn tạ
p.
Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) và (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c), TSA (d) hay đầu dò
polyribonucleotide (e)
(Moter et al., 2000).
Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dò tìm vi sinh vật bằng phương pháp FISH

Tên thuốc nhuộm
Bước sóng
Màu
Kích thích (nm) Phát xạ (nm)
AMCA 351 450 Xanh dương
FITC* 492 528 Xanh lá cây
FluoXE** 488 520 Xanh lá cây
TRITC*** 557 576 Đỏ
Texas Red 578 600 Đỏ
Cy3 550 570 Cam/Đỏ
Cy5 651 674 Hồng ngoại Bước sóng có thể thay đổi ít nhiều tùy thuộc vào nhà sản xuất. Quang phổ phát xạ
có thể thay đổi trong các dung môi khác nhau hoặc đặc tính của mẫu.

*FITC : Fluorescein–isothiocyanate

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
http://www.ebook.edu.vn 10

**FluoXE : 5-(-6-)carboxyfluorescein–N-hydroxysuccimideester
***TRITC : Tetramethyl–rhodamine–isothiocyanate
3.3. Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ

Trước khi tiến hành lai, mẫu chứa vi sinh vật và các đầu dò phải được ngâm
trong các hợp chất tạo tủa như ethanol hoặc methanol, hợp chất tạo được liên kết
ngang như aldehyde hoặc hỗn hợp các chất trên để các đầu dò huỳnh quang có thể

http://www.ebook.edu.vn 11

không đặc hiệu. Gần đây, FISH đã được áp dụng trên các mẫu mô tế bào được
ngâm trong dung dịch keo lạnh [101]. Trong các chất dẻo này, sự hiển thị của vi
khuẩn và sự bảo vệ cấu trúc của mô của các tế bào rất hoàn chỉnh mà không hề có
bất cứ quá trình tiền xử lý nào.
3.4. Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệuTrước khi tiến hành lai, các tế bào sau giai đoạn xử lý kể trên được cố định vào
một mặt kính. Để quá trình gắn mẫu vào mặt kính được tốt hơn, người ta khuyên
nên xử lý bề mặt kính trước bằng cách phủ lên mặt kính một lớp chất tráng kính
ngoài. Các hóa chất được sử dụng cho hiệu quả tốt là gelatin [8], poly-L-lysine [80]
hay các hợp chất tạo muối [101].
Quá trình lai phải được thực hiện trong những điề
u kiện hết sức nghiêm ngặt
nhằm kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ
sung với chúng. Đối với thao tác quan trọng nhất trong thí nghiệm FISH, quá trình
làm nóng sơ bộ các phân tử lai phải được thực hiện để các đầu dò huỳnh quang kết
hợp bổ sung với các trình tự RNA đích tương ứng. Sự chính xác khi bắt cặp bổ
sung có thể được điều khiể
n bằng cách thay đổi nồng độ formamide hay nhiệt độ
của quá trình. Formamide sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy của phân tử bằng cách
làm suy yếu liên kết hydro, từ đó cho phép tiến hành quá trình nhuộm ở nhiệt độ
thấp những vẫn đảm bảo độ chính xác cao.Quá trình lai xảy ra trong môi trường tối ẩm, nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50
o
C.

ử dụng kính hiển vi quét laze đồng tiêu thường đòi hỏi chất
lượng tín hiệu huỳnh quang cao hơn. Các tín hiệu huỳnh quang trong phương pháp
FISH còn có thể thu được khi sử dụng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy, đây là
một kỹ thuật cho đếm, kiểm tra, và phân loại các hạt nhỏ lơ lửng trong một dòng
chất lỏng. Do đó, phương pháp này không đưa ra được bất cứ thông tin về hình thái
hay sự phân bố không gian của vi sinh v
ật, nó chỉ thực sự phát huy hết khả năng
khi phân tích định lượng tự động, phân tích vi khuẩn trong dịch huyền phù hay hỗn
hợp vi sinh vật phù du và nó chỉ thực hiện được khi các đối tượng vi sinh vật có tần
số cao [7,131,150,152]. CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
http://www.ebook.edu.vn 13 Hình 4. Kính hiển vi
quét laze đồng tiêu

CHƯƠNG 4. NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI FISH
http://www.ebook.edu.vn 15

quang có thể hữu ích khi hoạt động như một chất phản nhuộm cho phép định
hướng trong các phần mô, nhưng nhìn chung các chất tự phát huỳnh quang làm
giảm tỷ lệ tín hiệu nhiễu lẫn tín hiệu đặc trưng. Trong lĩnh vực nghiên cứu di
truyền và miễn dịch, các đoạn mô tự phát huỳnh quang có thể loại bỏ thành công
bằng cách xóa dần từng điểm ảnh trong xử lý ảnh kỹ thuật s
ố [141,144].

Những phân tích, nghiên cứu hoàn chỉnh về hiện tượng tự phát huỳnh quang và
cách hạn chế các tín hiệu nhiễu đối với FISH là rất hiếm, tuy nhiên sự phát triển
các phương tiện, các kỹ thuật định hình và hệ thống thiết bị có vẻ như đã có những
ảnh hưởng đáng kể đến cường độ tín hiệu [54,132]. Phương pháp sử dụng bộ lọc
dải hẹp và hệ thống khuế
ch đại tín hiệu đã được đưa ra nhằm khắc phục những khó
khăn mà sự tự phát huỳnh quang gây ra [123,132]. Những nghiên cứu trên Candida
albicans đã chỉ ra rằng: tùy thuộc vào sự cố định mẫu và chiều dài bước sóng kích
thích, sự tự phát huỳnh quang sẽ biểu hiện khác nhau trên cùng một dòng vi khuẩn
đơn [54]. Vì vậy việc giải thích các tín hiệu huỳnh quang thu được khi nghiên cứu
trên nấm men và nấm mốc phải được thực hiện c
ẩn thận. Tuy nhiên, sự dò tìm đặc
hiệu nấm mốc và nấm men trong nuôi cấy mô tế bào, trong thí nghiệm với các mô
nhiễm độc, và trong mẫu máu người đã được thực hiện [86,87]. Tuy nhiên, khi
phân lập với các chủng vi khuẩn tạp hay các đoạn mô, phải có một bước kiểm tra
chất tự phát huỳnh quang trước khi tiến hành FISH.

4.1.2. Đầu dò thiếu tính đặc hiệu

Độ chính xác và độ tin cậy của FISH phụ thuộc nhiều vào tính đặc hiệu của các


4.2. Kết quả âm tính
4.2.1. Số lượng đầu dò quá ít

Cường độ tín hiệu thấp có thể do sự thâm nhập không đủ của đầu dò vào bên
trong tế bào vi khuẩn. Các đầu dò polyribonucleotide khi thấm vào tế bào vi sinh
vật gram âm thường không gặp phải bất cứ vấn đề nhỏ nào. Đối với vi sinh vật
gram dương, đặc biệt là những đầu dò có trình tự dài hoặc trung bình thì sử dụng
các acid mycolic kết hợp với cố định đặc hiệu và tiền xử lý có thể rất cần thi
ết.
FISH đã được sử dụng trên các cầu khuẩn gram dương [14,75], Corynebacterium
[119], Actinomyces [116,127], Bacillus [37] và Listeria [149].Tuy nhiên, các đặc điểm của thành tế bào đôi khi lại được sử dụng thuận lợi;
FISH đã được sử dụng để đánh giá tính chất của thành tế bào vi khuẩn [17]. Sử
dụng các đầu dò được đánh dấu HRP, Lactococcus lactis không thể phát hiện được
bởi FISH trừ khi nó bị nhiễm độc tố từ bacteriophage, dẫn đến sự biểu hiện của các

CHƯƠNG 4. NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI FISH
http://www.ebook.edu.vn 17

enzyme tự phân và tính thấm của tế bào. Tấn số các tế bào lai sẽ chỉ ra mức độ tự
phân trong môi trường nuôi cấy.
4.2.2. Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích

Do cấu trúc ba chiều của rRNA nên không phải tất cả các chuỗi trình tự đích
đều tiếp cận được với các đầu dò tương ứng. Cấu trúc vòng hoặc kẹp tóc cũng như
sự tương tác giữa rRNA và protein cản trở dẫn đến sự cảm biến khác nhau của các
đầu dò oligonucleotide. Điều này giải thích tại sao các đầu dò sử dụng tốt trong các

nhạy của phương pháp, có thể tiến hành đánh dấu đầu dò bằng nhiều chất huỳnh
quang khác nhau. Hai hay nhiều đầu dò đặc hiệu được đánh dấu với cùng một loại
thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng để làm tăng số lượng các phân tử huỳnh
quang trên mỗi tế bào [81]. Kỹ thuật này tất nhiên sẽ bị hạn chế bởi số lượng các
trình tự đích có s
ẵn ứng với các đầu dò bổ sung đặc hiệu.Như đã đề cập ở trên, độ nhạy của FISH cũng có thể được tăng lên nhờ sử dụng
hệ thống khuếch đại tín hiệu hoặc các đầu dò polyribonucleotide.

4.2.4. Ảnh chụp bị mất màu

Nhiều chất nhuộm huỳnh quang bị phai màu nhanh chóng theo sự kích thích
của bước sóng ánh sáng, dẫn đến không thể phục hồi những chỗ hư hỏng. Những
lần phơi sáng chỉ từ vài giây đến vài phút nhưng có ảnh hưởng rất quan trọng, đặc
biệt với ảnh chụp qua kính hiển vi. Để khắc phục những khó khăn này, việc sử
dụng bộ lọc dải hẹp, thuốc nhuộm cyanine b
ền quang học và các công cụ chống
phai màu được khuyến khích mạnh mẽ.

4.3. Biện pháp khắc phục
Sử dụng đầu dò vi khuẩn : Cách kiểm soát tốt nhất cho những kết quả bị âm
tính về khía cạnh phương pháp là sử dụng một đầu dò vi khuẩn. Nếu tiến hành lai
với một đầu dò phổ biến cho được kết quả khả quan trong FISH, thì việc cố định,
sự thẩm thấu và hàm lượng rRNA của vi khuẩn không còn là chỉ số hạn chế.
EUB338 [7] là
đầu dò thường được sử dụng cho mục đích này. Tuy nhiên, các
phân tích gần đây đã chỉ ra rằng một số ngành vi khuẩn bao gồm Planctomycetales
và Verhowrucomicrobia vẫn còn bị thiếu đầu dò này [28]. Vì vậy, sử dụng một tập