177
Chương 9
Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống
Thực vật
I. Mở đầu
bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gene ngoại lai trong tế bào thực
vật. Biến nạp của các tế bào vi khuẩn được thự
. Tuy
nhiên, việc cải biến di truyền ở thực vật bậc cao bằng cách đưa DNA
ngoại lai vào trong các tế bào của chúng là một quá trình rất phức tạp. Sử
dụng enzyme hạn chế (restriction endonucleases) để cắt phân tử DNA sợi
đôi thành những đoạn nhỏ riêng rẽ, phát triển kỹ thuật lai DNA-DNA và
các gene chỉ thị (marker genes) cho phép chọn lọc các tế bào
, động vật
và thực vật bậc cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin di
truyền mới được biến nạp vào các thực vật eukaryote biểu hiện không chỉ
ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền
lại cho các thế hệ sau của chúng.
Ý nghĩa thực tiễn của quá trình biến nạp là tạo ra những tính trạng mới
hoặc cải tiến những tính trạng đã có. Về một số phương diện nào đó, kỹ
thuật này có ưu điểm hơn so với phương pháp chọn giống bằng lai hữu
tính. Nếu ở phương pháp lai hữu tính, để chuyển được một gene hay một
số gene từ một giống này, qua một giống khác người ta phải tiến hành một
quy trình lai trở lại tốn rất nhiều thời gian và công sức. Trong khi đó kỹ
thuật chuyển gene không những cho phép vượt qua được những trở ngại
do sự xa cách về quan hệ họ hàng giữa thể cho gene và nhận gene mà còn
cho phép cây trồng tiếp nhận một cách nhanh chóng những gene mới do
con người thiết kế. Có thể thực hiện được điều này bằng cách sử dụng các
hệ thống vector sinh học, nhưng không phải đều có thể thực hiện được với

(particle bombardment) dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại
nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật. Việc biến nạp ở
các loài cây trồng gặp nhiều thuận lợi hơn. Các phương pháp biến nạp
khác cũng có hiệu quả đối với các trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng
ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế. Chẳng hạn các phương pháp biến
nạp gene bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng
phần, phương pháp xử lý hoá học bằng PEG (polyethylene glycol),
phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế
bào, phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các
mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào, phương
pháp biến nạp gene qua ống phấn....
Kể từ khi tạo được cây chuyển gene đầu tiên, đến nay kỹ thuật này đã
có những bước tiến rất lớn. Những thành công của nó không chỉ giới hạn ở
những cây mang tính chất mô hình như thuốc lá và các cây họ cà, mf còn
đạt được những kết quả ứng dụng ở một số cây trồng quan trọng. Vì thế
chúng ta có cơ sở để hy vọng rằng trong tương lai kỹ thuật gene sẽ trở
thành một công cụ hỗ trợ không thể thiếu được của chọn giống thực vật.
II. Kỹ thuật chuyển gene
1. Những nguyên tắc chung của kỹ thuật chuyển gene
Có một số yếu tố sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gene.
Không phải tất cả các tế bào trong cơ thể đều có tính toàn thể, các cây
khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gene
lạ. Một loại cây nào đó có thể được biến nạp khi nó có khả năng tái sinh
và chấp nhận sự biến nạp. Mô tế bào là một tập hợp của nhiều tế bào có
phản ứng khác nhau khi gặp một yếu tố tác động đến. Một số ít tế bào
trong cây có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Những tế bào 179
khác chỉ có một trong hai khả năng ấy. Một số lớn các tế bào trong cơ thể

Trong trường hợp này, thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi. Việc
biến nạp đối với các tế bào đơn của các mô phức tạp như phôi hay mô
phân sinh thường cho ra những cây khảm.
Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây
hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay
phát sinh phôi. Các chồi bất định hay các phôi được hình thành từ các tế
bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và
có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh.
2. Các phương pháp chuyển gene ở cây trồng
Khi sử dụng nấm men, nấm, động vật hoặc thực vật như là vật chủ cho
tạo dòng, cần có phương pháp đưa DNA vào trong tế bào của những sinh 180
vật này. Nói chung ở một số loài vi khuẩn tế bào được xử lý bằng dung
dịch muối. Ở tế bào nấm men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi tiếp xúc với
lithium chloride hoặc lithium acetat. Vì vậy người ta sử dụng phương pháp
này thường xuyên khi biến nạp nấm men (Saccharomyce cerevisiae). Đối
với phần lớn sinh vật bậc cao hơn đòi hỏi phương pháp tinh vi hơn.
2.1. Biến nạp vào tế bào riêng lẻ
Cản trở lớn nhất ở sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế
bào. Tế bào động vật không có thành. Trong nuôi cấy, chúng được biến
nạp dễ dàng, đặc biệt khi DNA gắn trên bề mặt của tế bào nhờ kết tủa với
calcium phosphat (hình 9.1a). Các enzyme được sử dụng làm mất thành tế
bào của nấm men, các loại nấm khác, tế bào thực vật, và dưới những điều
kiện thích hợp, người ta có thể tạo ra tế bào trần (hình 9.1b). Tế bào trần
tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng. Có thể thực hiện chuyển nạp bằng
những phương pháp khác nhau:

Hình 9.1 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào

DNA của Ti-plasmid là T-DNA xâm nhập vào hệ gene của cây bị bệnh.
2.1.1.1. Ti-plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật
Tạo khối u
Tổng hợp nopaline
Sử dụng
nopaline
Điểm xuất phát
sao chép
Các chức năng
chuyển T-DNA 182
Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D.
Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là T-
DNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc
(oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone
auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự
phân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme
điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đường
gọi là opine. Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopine
synthetase và nopaline synthetase.
Vùng B có liên quan đến sự tái sinh
Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp
Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong
việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật
Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNA
mã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡng
cacbon và nitrogen cho vi khuẩn.
2.1.1.2. T-DNA và các trật tự biên 25 bp

hydroxyacetosyringon.
2.1.1.4. Quá trình chuyển T-DNA
Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạt
hoá nhờ hoạt động của các gene vir. Hoạt động này xảy ra khi
Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từ
vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast.
Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA
(protein virA). Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium,
đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môi
trường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việc
phosphoryl hoá) gene virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huy
nằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác. Bằng cách như vậy,
protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã của
chính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E.
Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt
Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư của
mạch đơn phía dưới mới được tổng hợp. Từ đó, một mạch T-DNA được
giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới được
tổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điều
này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA.
Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nói
trên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường
nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virC
mã hoá. Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra
làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Phức
hợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T-
DNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium.
Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối,
cho phức hợp trên chuyển từ Agrobacterium sang tế bào thực vật.
Tế bào thực vật bị thương tổn là nơi chuyển gene T-DNA. Trong các

tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) ở trên màng tế bào và DNA có thể xâm
nhập vào chất nguyên sinh. Bên cạnh những phương pháp biến nạp, người
ta còn sử dụng các phương pháp vật lý để đưa DNA vào trong tế bào.
2.1.3. Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene

Hinh 9.5 Tái sinh cây từ protoplast 186
Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng
thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới.
Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu
tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng viên đạn
có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng
tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào.
1-1,5 μm được dùng làm vi đạn
(microprojectile). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp
cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quang vi đạn, hỗn
hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa
kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với
nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu
nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra khỏi đầu
nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp
tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất
định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá
trình biến nạp gene (Hình 9.6).

Hình 9.6 Sơ đồ súng bắn gene
2.1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm
(microinjection)

thừng loại cây trồng và quá trình biến nạp gene vẫn còn bị hạn chế ở nhiều
loài. Ở đây chỉ minh hoạ các kết quả biến nạp gene thành công ở các giống
cây trồng quan trọng.
- Cây ngô:
1988). Tuy nhiên, có thể
dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh
các cây hữu thụ mang gene biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gene và
chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát
sinh các phôi được biến nạp gene. Các cây biến nạp gene hữu thụ đã được
tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gene bar
) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme
phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau.
Hiện nay biến nạp gene ở ngô bằng phương pháp bắn gene đã được sử
dụng rộng rãi. Gần đây các kết quả biến nạp gene gián tiếp ở ngô nhờ
Agrobacterium cũng đã được thông báo. Các thể biến nạp gene của dòng
ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung
(cocultivation) giữa vector “super-binary” với phôi non. Tần số được
thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30%. Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa
dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4-
5,3% (tính theo số cây biến nạp gene độc lập/phôi). 188
9.1.
TT Loài Phương pháp biến nạp gene Thử nghiệm đồng ruộng
1 Chuối Bắn gene/Agrobacterium -
2 Luá mạch Bắn gene Kháng virus
3 Đậu tây Bắn gene -
4 Canola Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ,
điều khiển sự thụ phấn

189
nay, hơn 40 giống đã được biến nạp gene thành công. Mẫu vật sử dụng là
phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành. Hygromycin B là
marker chọn lọc thường dùng cho lúa. Tần số biến nạp có thể cao tới 50%
(tính theo số cây biến nạp gene có nguồn gốc độc lập/ số mẫu được bắn
gene). Gần đây, kỹ thuật biến nạp gene ở lúa thông qua Agrobacterium
cũng đã có những cải tiến có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gene.
- Cây lúa mì: Phương pháp bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp
gene ở lúa mì. DNA ngoại lai được bắn vào trong vảy nhỏ (scutellum) của
phôi non của hai giống lúa mùa xuân và một giống lúa mùa đông. Các
callus chống chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố
ức chế trao đổi chất tương tự như basta, bialaphos hoặc glufosinate
ammonium. Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và
kết quả là một số lớn cây thất thoát. Phân tích di truyền và phân tử đã xác
nhận sự hợp nhất ổn định của các gene biến nạp. Nói chung công nghệ di
truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả
năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gene.
- Cây lúa mạch: Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn
các cây lúa mạch biến nạp gene độc lập, tự thụ phấn. Các phôi hợp tử non,
các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn
đã được dùng để bắn gene với plasmid mang gene bar gus
lùn vàng ở lúa mạch. Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để phân
lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc
dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của
gene.
- Cây đậu tương: Những cố gắng đầu tiên của cây đậu tương biến nạp
tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát
sinh phôi. Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc
này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gene vẫn đang còn
gặp nhiều khó khăn. Công nghệ biến nạp gene ở đậu tương đã có triển

thuật bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene gusA được điều khiển
bằng promoter concanavalin A, hoạt tính gus đã biểu hiện trong lá mầm và
vỏ hạt của các cây biến nạp.
- Cây bông: Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium
tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gene vào cây
bông giống Coker 312 (Umbeck 1987). Cây bông biến nạp gene cũng của
giống t
1990). Hầu hết các giống bông có giá
trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus. Một số ít các
giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô
tính (somaclonal variation). Phương thức phân phối gene ngoại lai trực
tiếp vào mô phân sinh của trụ phôi cũng đã được phát triển và đã phục hồi
cây biến nạp gene.
2.3.2
sống tự do hoặc cộng sinh tồn tại
phương thức biến đổi nitơ phân tử của khí trời thành dạng NH
3
.
Nitrogenease
N
2
...
NH
3

- nif) chỉ tồn tại ở
một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu
(Fabaceae). Dùng kỹ thuật tách gene nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển
sang các cây trồng quan trong như lúa, ngô là một mô hình lý tưởng của
các nhà tạo giống (Hình 9.8).

các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau. Độ sai khác càng xa
thì sự biến chủng càng lớn. Khi độ sai khác cao hơn mức xác định, các cá