101
Chương 6
Các Phương pháp trong Chọn giống
Thực vật

I. Các phương pháp chọn lọc cơ bản
Chọn lọc là một trong những phương pháp cơ bản và quan trọng được
ứng dụng rộng rãi trong chọn giống. Có hai kiểu chọn lọc cơ bản, đó là:
chọn lọc theo kiểu hình và chọn lọc theo kiểu gene; nhưng tất cả đều dựa
trên cơ sở là nguồn biến dị di truyền của sinh vật.
Ngày nay chúng ta đều biết rằng, chỉ có các biến dị di truyền (các đột
biến, biến dị tổ hợp) mới đóng vai trò là nguồn cung cấp nguyên liệu cho
quá trình chọn lọc và tiến hoá của sinh vật.
Trong khi Darwin xây dựng thuyết chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân
tạo, ông cũng đã phân bịêt được các biến dị di truyền (biến dị không xác
định) và biến dị không di truyền (biến dị xác định), nhưng chưa giải thích
được nguyên nhân của chúng. Về vai trò sáng tạo của chọn lọc,
+ Chọn lọc tự nhiên
Theo quan điểm của Darwin, sinh vật không ngừng phát sinh các biến
dị cá thể trong quá trình sinh sản và dưới tác dụng của các điều kiện môi
trường sống. Chỉ những biến dị nào có lợi cho bản thân sinh vật thì được
giữ lại, còn các biến dị nào không có lợi thì bị đào thải. Chọn lọc tự nhiên
thường xuyên diễn ra, giúp cho sinh vật mang các biến đổi thích nghi trên
cơ thể ngày càng hợp lý. Có những trường hợp chọn lọc tự nhiên thúc đẩy
và hỗ trợ cho chọn lọc nhân tạo, làm cho quá trình chọn lọc phát huy
nhanh hơn. Ví dụ, đặc tính chống chịu sâu bệnh, chịu hạn của cây trồng
vừa có lợi cho con người, vừa có lợi cho sinh vật. Ngược lại, đối với một
số đặc tính như rụng hạt ở cây ngũ cốc, chất lượng nông sản cao... thì giữa
chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo mâu thuẫn nhau. Do vậy sự thúc
đẩy quá trình hình thành giống mới xảy ra chậm hơn. Vì vậy trong công

một số loài cây tự thụ như: đậu tương, cà chua, lúa mì, lúa... Hạt lai
thương mại hiện nay đã được áp dụng rộng rãi ở cả các cây tự thụ phấn và
cây giao phấn (xem chương 4).
3. Cấu trúc của bộ máy di truyền tế bào
Mức độ đa bội có ảnh hưởng nhất định đến chiến lược chọn giống cây
trồng: tứ bội thể được dùng thông dụng ở các loài cây thức ăn gia súc
nhằm làm tăng sản lượng chất khô và các đặc tính tốt khác. Việc chọn lọc
một tính trạng nào đó như khả năng chống chịu sâu bệnh của củ cải
đường, khoai tây... bằng cách chọn các dạng tam bội tỏ ra có hiệu quả hơn.
4. Tính trạng số lượng và tính trạng chất lượng
Tuỳ theo tính trạng nhà chọn giống quan tâm là tính trạng số lượng
hay tính trạng chất lượng mà có các phương pháp chọn lọc khác nhau.
Thông thường, tính trạng chất lượng được kiểm tra bởi một gene, còn tính
trạng số lượng do nhiều gene kiểm tra và chịu ảnh hưởng lớn bởi môi
trường và tác động qua lại giữa các gene.
Đối với tính trạng số lượng, phương pháp chọn giống thường được áp

103
dụng là chọn lọc theo chu kỳ hay chọn lọc hồi quy. Càng có nhiều gene
tham gia thì sẽ ít có cơ hôi tạo ra sự ngẫu nhiên để đạt được một tổ hợp
gene tốt nhất của một chu kỳ chọn lọc. Do vậy cần có sự phối hợp của
chọn lọc nhằm làm tăng các tổ hợp tốt nhất ở chu kỳ tiếp theo. Trong
trường hợp này, phương pháp chọn giống hồi quy giúp thu được các tính
trạng tốt ở mỗi chu kỳ.
5. Sự hoạt động của các gene (xem cơ sở di truyền học của hiện tượng ưu
thế lai, chương 4)
III. Các nguyên tắc cơ bản của chọn lọc
Ngoài những nguyên nhân khách quan ảnh hưởng đến quá trình chọn
lọc như mức độ biến dị của tính trạng được chọn à phương pháp chọn lọc,
thì nguyên nhân chủ quan cũng góp phần quan trọng và mang tính quyết

trường phù hợp: Chẳng hạn, trong việc chọn các giống chịu mặn, chịu
úng, chịu hạn... thì các vật liệu chọn giống cần trồng trong điều kiện tự
nhiên tương ứng như: mặn, úng, hạn.... Hoặc trong đánh giá khả năng
kháng bệnh cũng vậy, vật liệu chọn tạo cần gieo trồng trong mùa vụ có
dịch bệnh phát sinh mạnh nhất.
(7) Kết hợp chọn lọc ở trong phòng và trên đồng ruộng trong suốt thời
kỳ sinh trưởng của giống, khi đó các giống cây trồng mới được chọn ra
một cách nhanh chóng và chuẩn xác.
IV. Sơ lược về các phương pháp chọn giống truyền thống và hiện
đại thông dụng
1. Một số phương pháp chọn giống truyền thống
Chọn giống là một quá trình liên tục để thoả mãn nhu cầu thay đổi của
một nền nông nghiệp. Nói chung, các phương pháp chọn giống truyền
thống vẫn tương đối phổ biến, trong đó tái tổ hợp giữa các kiểu gene ưu tú
vẫn là khâu then chốt để tạo ra vật liệu chọn giống cho quá trình chọn lọc.
Các phương pháp chọn giống truyền thống dựa vào sự tái tổ hợp của các
gene và nhiễm sắc thể thông qua sinh sản hữu tính của sinh vật (tuân theo
các nguyên lý di truyền cổ điển của Mendel và Morgan).
Các quy trình chọn giống khác nhau đã được sử dụng cho các kiểu cây
trồng khác nhau, tuỳ thuộc vào phương thức sinh sản là tự thụ phấn hay
giao phấn. Đối với lúa, phương pháp chọn giống theo phả hệ là thông
dụng nhất. Các bố mẹ được chọn kỹ lưỡng và lai thông qua thụ phấn bằng
tay (Hình 6.1). Trong chương trình chọn giống kháng, thông thường một
dạng bố mẹ là giống đã được cải tiến và dạng kia là một giống kháng hoặc
loài hoang dại. Phải mất vài thế hệ lai và chọn lọc để chuyển gene kháng
cho dạng bố mẹ đã được cải tiến và phục hồi các đặc tính mong muốn của
dạng bố mẹ cải tiến (năng suất, chất lượng hạt, v.v.). Tại Viện nghiên cứu
lúa quốc tế (IRRI, đặt tại Manila - Philippines), mỗi năm có tới hàng chục
ngàn dòng chọn giống được kiểm tra và lưu giữ về khả năng kháng rầy
nâu và sâu hại lá. Tại đây đã lai tạo và phóng thích nhiều giống lúa mới

tăng năng suất cây trồng, vật nuôi. Trong trồng trọt và nhất là trong cải

106
lương giống cây trồng, hầu hết các quy trình CNSH sử dụng nuôi cấy mô
và tế bào in vitro từ mảnh mô, tế bào phân lập, mô sẹo, tế bào trần hoặc
mô phôi để thực hiện quá trình biến đổi, rồi sau đó cho tái sinh cây hoàn
chỉnh. Điều cần thiết là phải hiểu và nắm vững sự tái sinh cây từ nuôi cấy
mô đối với từng loại xác định trước khi áp dụng để bổ sung cho phương
pháp chọn tạo giống hiện hành. kết quả nuôi cấy mô và tế bào mấy chục
năm qua cho thấy nuôi cấy tế bào từ các loài cây trồng khác nhau hay các
kiểu gene khác nhau trong nội bộ một loài, hoặc thậm chí từ các bộ phận
khác nhau trên cùng một cây có phản ứng khác nhau đối với một kỹ thuật
nuôi cấy cụ thể. Điều này đã cản trở việc xây dựng các qui trình đồng nhất
để có thể áp dụng thường xuyên trong các chương trình chọn giống cho
nhiều loài cây trồng. Để ứng dụng kỹ thuật này trong chương trình chọn
tạo giống cần phải vạch ra các quy trình cụ thể cho từng loại vật liệu di
truyền và môi trường nuôi cấy.
2.1. Nuôi cấy mô và tế bào
Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh tính toàn năng của tế bào
soma ở thực vật và chỉ ra khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh bằng con đường
nuôi cấy mô và tế bào. Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc tái sinh cây hoàn
chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào trần (protoplast) mới trở thành hiện thực.
Nuôi cấy mô và tế bào là kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật phân lập
hay mảnh mô thực vật tách rời trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện
vô trùng. Sau đó, các mô cấy được cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Người ta đã xây dựng được các quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh
cây cho một số loài như thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan, một số cây ăn
quả v.v. Đối với phần lớn cây trồng trên đồng ruộng, như bông và đậu lấy
hạt thì việc thiết lập các quy trình để áp dụng rộng rãi khó hơn nhiều. Ở
những loài cây này tần số tái sinh thấp và kết quả tái sinh từ nuôi cấy

thành cây con. Thông qua sử dụng phương pháp này người ta đã tạo ra
nhiều con lai khác loài ở nhiều loại cây trồng như lúa mì, lúa nước, đại
mạch, bông, đậu, đỗ, các loài cây ăn quả, cây cảnh và nhờ vậy nhiều gene
có ích đã được chuyển vào cây trồng.
Noãn đã thụ tinh đôi khi được nuôi cấy để cứu phôi từ các tổ hợp lai
xa mà không cần tách phôi ra khỏi noãn. Noãn chứa phôi lai non được
tách ngay sau khi thụ tinh trong điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên môi
trường dinh dưỡng. Bằng con đường nuôi cấy noãn phôi có thể nuôi cấy ở
giai đoạn sớm hơn so với nuôi cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phôi phát triển
trong noãn có môi trường hoá học và lý học thuận lợi hơn phôi nuôi cấy
bên ngoài noãn.
Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu nhập noãn chưa thụ tinh,
cấy noãn trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng, và thụ
phấn cho noãn với các hạt phấn tươi. Ống phấn xuyên qua thành noãn và
túi phôi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng. Phương pháp này đã được áp dụng để
tạo con lai giữa các loài mà ống phấn không thể sinh trưởng và xuyên vào
noãn bình thường sau khi thụ phấn.
(2) Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây đơn bội:
Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc tạo giống mới cải
tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F
2
lớn và chọn lọc các dòng mong
muốn trong các thế hệ phân ly từ F
2
đến F
7
để cuối cùng tạo ra các dòng
đồng hợp tử. Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để
tạo ra các dòng đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do


Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là
biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983).
Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và
mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của
genome. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di
truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng
và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng. Một số thể biến dị dòng
soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus Fiji, bệnh
đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977);
khả năng kháng bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng

109
sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh
ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996).
Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình nuôi cấy là khả
năng chọn lọc dòng tế bào in vitro. Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế
bào trong một không gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và chọn lọc
bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong điều kiện bất lợi là tác nhân chọn
lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý đột biến trong nuôi cấy để tăng tần số biến
dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu hiện ở mức tế bào mới
có thể xác định được bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm các đặc
tính như kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt, nhôm,
axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả
năng kháng độc tố do các tác nhân gây bệnh tạo ra. Các kiểu gene phân
lập kháng với các điều kiện bất lợi này có thể được sử dụng trực tiếp trong
chương trình chọn giống.
2.2. Lai tế bào soma hay dung hợp tế bào trần
Trong các phương pháp chọn tạo giống truyền thống lai hữu tính là
phương pháp cơ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao
tử. Tuy nhiên, việc lai hữu tính chỉ thực hiện được các cá thể trong một

một gene có chức năng mã hoá cho một thông tin hay đặc điểm có lợi nhất
định vào tế bào thực vật như khả năng kháng sâu hại, kháng virus hay
kháng thuốc trừ cỏ. Cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gene lạ được lồng
vào genome, biểu hiện ra kiểu hình va di truyền ổn định được gọi là cây
chuyển gene. Gene lạ có thể có nguồn gốc từ vi sinh vật thực vật, động
vật, thậm chí gene tổng hợp. Quá trình chuyển gene bao gồm nhiều bước:
xác định và phân lập gene có ích, nhân gene, chuyển gene vào tế bào thực
vật, tái sinh tế bào chuyển nạp thành cây hoàn chỉnh và đánh giá sự biểu
hiện của gene.
Trong các bước trên, kỹ thuật chuyển gene đóng một vai trò quyết
định đối với kết quả chuyển gene. Chuyển gene vào tế bào thực vật có thể
thực hiện gián tiếp thông qua vector hay trực tiếp. Sau đây là ví dụ về sự
chuyển qua thông qua Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens.
A. tumefaciens là vi khuẩn gây khối u ở cây hai lá mầm và phản ứng
hình thành khối u là kết quả của sự kiện chuyển gene tự nhiên. Mấu chốt
của sự hình thành khối u là Ti-plastmid (Ti: tumor inducing) của vi khuẩn
chứa các gene mã hoá sinh tổng hợp các horrmon (auxin và cytokinin)
chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u. Các gene này nằm trong vùng
T-DNA (transfered DNA) của plasmid. Khi plasmid xâm nhập vào tế bào
của cây, cùng T-DNA được chuyển vào genome. Đoạn T-DNA là yếu tố
di truyền vận động trong quá trình chuyển gene.
Ý nghĩa của Agrobacterium trong kỹ thuật di truyền là khả năng
chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật. Lợi dụng phương thức chuyển
gene tự nhiên các nhà khoa học thực vật dựa vào kỹ thuật phân tử điều
khiển T-DNA để thiết kế hệ vector bằng cách lồng đoạn DNA cần chuyển
gắn vào cùng T-DNA của vi khuẩn, sau đó cho cây nhiễm các vi khuẩn
chứa plasmid đã biến đổi. Để lây nhiễm người ta nuôi cấy tế bào trần thực
vật, tế bào đơn trong trong mooi trường lồng, hoặc đặt mô cấy trong dung
dịch huyền phù chứa vi khuẩn có plasmid biến đổi trong một thời gian

Cách ly phôi
từ hạt lúa
Phôi
Cây lúa
chuyển gene
Tái sinh các cây mạ từ
các mô sẹo phát triển
từ phôi được biến nạp
Cho các phôi sinh trưởng trên
môi trường để xác định các
phôi nào đã được biến nạp
gene Bt
Hình 6.2
Tạo giống lúa Bt bằng phương pháp súng bắn gene (particle
bombardment method). Đây là một trong nhiều phương pháp có thể sử dụng để
chuyển các gene mới sang cây lúa bằng kỹ thuật di truyền.
Ở một số loài cây dễ nuôi cấy như khoai tây và cà chua, các mẫu lá cắt

112
rời được nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn trong một thời gian ngắn.
Sau đó các mẫu lá được đưa vào môi trường dinh dưỡng. Trong khoảng
thời gian đó vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và xâm nhập vào các tế bào lá
rồi tạo ra một số tế bào chuyển gene. Vì chỉ một phần nhỏ tế bào được
chuyển gene nên cần phải tiến hành chọn lọc. Việc chọn lọc thông thường
dựa vào gene chọn lọc, đó là gene kháng kháng sinh hay kháng thuốc trừ
cỏ. Sau đó các mẫu lá được chuyển vào môi trường khác chứa một chất
kháng sinh để diệt Agrobacterium còn sót lại và một chất kháng sinh khác
hay thuốc trừ cỏ để loại trừ các tế bào không chuyển gene.
Các tế bào được chọn được chuyển sang một loạt các môi trường dinh
dưỡng để tái sinh cây. Kết quả tái sinh và tạo cây chuyển gene phụ thuộc