Download miễn phí Luận văn Xây dựng quy trình định lượng CYTOMEGALOVIRUS (CMV) trong máu và nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR
Một yêu cầu quan trọng của hệ primers và TaqMan probe là nó phải khuếch đại đúng trình tự
mục tiều cần quan tâm. Ngoài trình tự mục tiêu của loài đang khảo sát, primer và probe không được
bắt cặp lên các trình tự của loài khác. Do đó việc xác định khả năng nhân bản chọn lọc của primer
luôn luôn được đòi hỏi. Việc xác định này phải được thực hiện trên cả lý thuyết và thực nghiệm.
Trên lý thuyết, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb 4.942 để kiểm tra sự bắt cặp của primer
trên genome của một số loài cùng họ như HSV1, HSV2, EBV và một số loài khác HBV, HCV,
HPV, MTB .
Trên thực nghiệm đối với mỗi tác nhân, chúng tôi tiến hành song song hai phản ứng Real-Time PCR. Một chúng tôi dùng hệ primers và TaqMan probe đã thiết kế chạy với những mẫu bệnh
phẩm nhiễm HSV1, HSV2, EBV, HBV, HCV, HPV,MTB đã được khẳng định dương tính. Một
phản ứng với các cặp primer-TaqMan probe đặc hiệu cho từng tác nhân.
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-10-31-luan_van_xay_dung_quy_trinh_dinh_luong_cytomegalov.v3PIoXnYcF.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-42868/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
ng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của
phản ứng PCR.
Nguyên tắc thiết kế primer:
- Hàm lương GC từ 50-60%.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) từ 50-65
0C. Giá trị Tm được tính bằng phương pháp lân cận
gần nhất với giá trị của 50mM nồng độ muối và 300nM nồng độ oligonucleotide.
- Tránh cấu trúc thứ cấp.
- Tránh lặp lại base G, C hơn 3 lần.
- Thiết kế base G và C ở đầu và cuối primer. Thành phần 5 nucleotide cuối cùng ở đầu
3’ không nên có hơn 2G hay C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR.
- Kiểm tra trình tự của primer xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp ở đầu 3’( tránh
tạo ra primer-dimer).
- Kiểm tra sự đặc hiệu bằng những công cụ như Basic Local Alignment Search Tool
(
Thiết kế TaqMan probe:
Nguyên tắc thiết kế TaqMan probe:
- TaqMan probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn primer 5-100C (vì ở giai đọan 600C là nhiệt
độ bắt cặp tối ưu của TaqMan probe, TaqMan probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi primer mới
bắt cặp) .
- Ngắn hơn 30 nucleotide và không có base lọai G ở đầu 5’ bởi vì nó có thể hấp thụ tín hiệu
hùynh quang ngay cả khi TaqMan probe bị cắt đứt.
- Trình tự TaqMan probe cần có hàm lượng GC từ 30-80% và TaqMan probe phải có nhiều
base C hơn base G.
- Vị trí bắt cặp ở đầu 5’ của TaqMan probe nhưng không kéo dài đầu 3’ của primer, cách vị
trí 3’ của primer bắt cặp trên cùng sợi đích khoảng 2-5 base.
- Quan trọng là lựa chọn chất phát và chất hấp thụ hùynh quang .
Đề tài chọn kiểu phản ứng singleplex, cho nên probe sẽ chọn chất FAM (6-
carboxyfluorescin) làm chất phát huỳnh quang, và TAMRA (6-carboxytetra-methylrhodamine) làm
chất hấp thụ huỳnh quang vì giá thành thấp, có sẵn, hiệu quả tốt và tín hiệu có thể phát ra bởi bất kỳ
thiết bị nào hiện có.
Cách tiến hành thiết kế hệ primers và TaqMan probe
Cách sử dụng phần mềm ClustalX
Sau khi chạy ClustalX các đoạn gene UL123 tải về, so sánh trình tự và xác định vùng bảo tồn
(vùng có các trình tự tương đồng của tất cả các đoạn gene), và dựa vào các cặp primer và TaqMan
probe đã được công bố trên các bài báo uy tín quốc tế [26], [42], [48], [56], [58], [69] để chọn
primer và TaqMan probe, chạy ClustalX các đoạn gene UL123 với từng primer xuôi, primer ngược
và TaqMan probe, đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên.
Mở chương trình ClustalX đã gióng cột.
Vào file/ append sequenses/ trong hộp append khai báo file primer/open.
Hình 2.4: Minh họa cách gióng cột primer trong ClustalX
Ta được:
Hình 2.5: Primer được nối vào cột ClustalX
Tiếp tục vào menu alignment/ Do complete alignment/ khai báo địa chỉ lưu/OK ta
được kết quả sắp gióng cột primer xuôi, primer ngược, và TaqMan probe (mẫu dò) (hình 3.1, hình
3.2, hình 3.3).
Cách sử dụng phần mềm Blast
Sau bước đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên, ta phân tích và đánh giá hệ
primers, probe về Tm, %GC, hairpin (kẹp tóc), self–dimer, hetero– dimer, độ tương đồng, kích
thước sản phẩm PCR tạo thành bằng các chương trình BLAST, Annhyb4-922, Oligo Analyzer 3,0
của IDT ( analyzer/oligocal,asp).
Vào
Chọn nucleotide blast
Trong vùng : Choose Search Set, dòng database : chọn nucleotide colletion
Trong vùng : Program Selection, chọn Optimize for Somewhat similar sequences
(blastn).
Coppy cấu trúc primer vào vùng Enter Query Sequence, và click nút blast, kết quả tương
đồng giữa primer và probe giúp ta xác định độ đặc hiệu của primer và probe được thiết kế so với
gen CMV.
Cách sử dụng phần mềm Annhyb 4.942
AnnHyb 4.942 (Annealing and Hybridization) là phần mềm miễn phí dùng để phân tích trình
tự nucleotide với các đặc trưng như chuyển đổi qua lại giữa các định dạng trình tự, dịch mã, phân
tích bảng đồ cắt giới hạn, tìm motif, khung đọc mở.
Mở phần mềm Annhyb 4.942
Vào Menu Oligo, chọn New Oligo
Phần Name: Nhập tên đoạn Oligo vào
Note: Chọn màu đoạn primer, hay TaqMan probe
Seq, 5’: Nhập trình tự primer hay TaqMan probe vào
Ta vào Menu Oligo, chọn Align Oligo with Sequences. Ta có kết quả Align của primer và
trình tự.
Cách sử dụng Oligo Analyzer 3.0 của IDT
Vào
Vùng : Sequence nhập trình tự mối và probe theo chiều 5’- 3’,
Để kiểm tra cấu trúc thứ cấp nào thì ta chọn vùng đó, sau đó click nút submit
Để kiểm tra đặc tính ta chọn analyze.
Từ đó chọn cặp primers, TaqMan probe tốt nhất để chạy phản ứng Real - Time PCR.
Gởi công ty IDT (Intergrated DNA Technologies) của Mỹ thiết kế.
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA –CMV
Có thể tách chiết DNA-CMV từ nhiều dịch sinh học khác nhau như máu, nước tiểu, hay
dịch sinh học khác. Và cũng có nhiều phương pháp khác khau để tách chiết DNA như phương pháp
BOOM, CTAB, hay phenol-chloroform. Mỗi phương pháp sẽ có một nguyên tắc riêng, nhưng
nguyên tắc chung là:
1. Phá vỡ tế bào, màng và phân hủy protein để giải phóng DNA.
2. Xử lý bằng nhiệt để phá hủy hoàn toàn protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân.
3. Tách DNA ra khỏi đệm tách và bào quản DNA ở 4 đến 200C.
Riêng đề tài này chúng tui chọn phương pháp tách chiết bằng phenol chloroform [2].
Nguyên tắc: mẫu bệnh phẩm khi trộn với dung dịch phenol /chloroform /Izoamyl
alcohol(P/C/I=25:24:1) thì các protein trong mẫu sẽ bị phenol làm biến tính và vón cục lại. Khi ly
tâm, nhờ có sự hiện diện của chloroform, các vón cục sẽ bị tách ra và tập trung trong lớp phân cách
giữa nước và P/C/I (Chloroform thường đi kèm với phenol có tác dụng bổ sung và làm mất hoàn
toàn dấu vết của phenol, Chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol).
Pha nước chứa DNA sẽ được lấy ra và làm kết tủa trong izopropanol có bổ sung chất trợ tủa
(chất trợ tủa có tác dụng bắt các phân tử DNA, nhưng không ức chế phản ứng PCR). Khi thực hiện
với sự có mặt của chất trợ tủa, quá trình tủa có thể xảy ra ở nhiệt độ phòng với thời gian ngắn (10
phút). Trong điều kiện không có chất trợ tủa, quá trình tủa phải thực hiện ở - 200C trong ít nhất 1
giờ.
DNA sau khi được tủa sẽ rửa lại 1 lần với ethanol 70% và cuối cùng được bảo quản trong
TE1X (T: Tris có vai trò ổn định pH và E: EDTA bắt các ion Mg2+ làm cho DNase không hoạt
động).
2.3.2.1. Quy trình xử lý nước tiểu và tách chiết DNA trong nước tiểu [17], [18], [19],
[25], [26], [34],[35], [37], [40], [43], [44], [61].
Phương pháp này sử dụng proteinase K để thủy giải toàn bộ proteine có trong mẫu nước tiểu.
Bước 1: Lấy 6 ml nước tiểu cho vào fancol 15ml, ly tâm tốc độ 4000v/p trong 30phút
Bước 2: Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn và cho vào 200µl TE1X (0,1M NaCl, 10 mM Tris-HCl,
1mM EDTA- pH=8,0) +0,1% SDS và 40µg proteinase K, ủ ở 370C trong 3 giờ, tốt nhất là ủ qua
đêm. Sau đó có thể đun nóng mẫu ở 1000C trong vài phút để bất hoạt proteinase K còn lại. Mẫu thử
lúc này có thể sẵn sàng để tách chiết DNA.
Bước 3: Lấy 200 µl mẫu tiến hành tách chiết DNA bằng tủa phenol : cloroform:
isoamylalcool (25:24:1) giống quy trình tách chiết DNA trong huyết thanh.
2.3.2.2. Quy trình tách chiết DNA trong máu hay huyết thanh, nước tiểu (hình 2.6):
Bước 1: Đánh dấu các tube 1,5ml vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
Bước 2: Cho 200l mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900l dung dịch 1 (triozol), vortex 30s,
để yên 10 phút, th...
