Download miễn phí Luận văn Nghiên cứu thu nhận enzym anpha – amylase từ trực khuẩn cỏ khô



MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cám ơn
Mục lục
Các chữ viết tắt trong luận văn
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị và biểu đồ
Mở đầu . . 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . .4
1.1. Gi?ng vi khuẩn Bacillus . .4
1.2. Khái quát chung về enzym . .8
1.2.1. Enzym cảm ứng. . . 9
1.2.2. Bản chất sinh học của enzym. . . 9
1.2.3. Bản chất hoá học của enzym . . .10
1.2.4. Tính chất hoá họccủa enzym . . 11
1.2.5. Cấu trúc enzym. . . .11
1.2.6. Cơ chế tác dụng của enzym . . . 11
1.2.7. Các yếu tố ảnhhưởng đến vận tốc phản ứng enzym .12
1.3. Hệ enzym amylase . 15
1.3.1. Giới thiệu enzym a– amylase. .15
1.3.2 Nguồn thu nhận enzym amylase .18
1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của VSV . 19
1.3.4. Tách chiết enzym từ các nguồn nguyên liệu . .22
1.3.5 Ứng dụng của amylase trong thực tế sản xuất và đời sống . 23
ChuongII: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27
2.1 Vật liệu .27
2.2. Các môi trường được sử dụng. 28
2.3. Các phương pháp nghiên cứu .28
2.3.1. Phương pháp phân lập các chủng Bacillustừ đất vườn qua cỏ khô .28
2.3.2. Phương pháp giữ giống cấychuyền . . .29
2.3.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học củaBacillus .29
2.3.4. Phương pháp xác định sự sinh trưởng theomật độ quang .32
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân huỷ tinh bột 32
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt độ a-amylase theo Heinkel, 1956 .33
2.3.7. Các phương pháp nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy .35
2.3.8. Phương pháp phân loại để xác định loài . . .37
2.3.9. Phương pháp nghiên cứu động học . . .38
2.3.10. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzym amylase từ môi trường .39
2.3.11. Phương pháp thu nhận CPE a– amylase 39
2.3.12. Xác định hoạt độ CPE amylase thu được từ các tác nhân tủa 41
2.3.13. Xác định độ bền của CPE amylase . . 41
2.3.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm . 42
CHUONGIII: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .46
3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủngcó hoạt tính amylase cao . .44
3.2. Xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase của 3 chủng CK . 45
3.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng CK2 . 47
3.4. Nghiên cứu các điều kiện sinh tổng hợp amylase . 49
3.4.1. Loại cơ chất .49
3.4.2. Ảnh hưởng nồng độ tinh bột tan 52
3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ .53
3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu. . .54
3.4.5. Ảnh hưởng củađộ hiếu khí .55
3.4.6. Ảnh hưởng của các loại muối 56
3.4.7. Nồng độ NaCl cao nhất ức chế sinh trưởng .59
3.5. Xác định tên của chủng CK2 đã tuyển chọn 60
3.6. Nghiên cứu động học của quá trình lên men .60
3.7. Tách enzym từ dịch nuôi cấy, xác định hoạt độ và độ bền của enzym 62
3.7.1. Tách enzym từ dịch nuôi cấy với các tác nhân tủa khác nhau .62
3.7.2. Hoạt độ của CPE amylase thu được bởi các tác nhân tủa .63
3.7.3. Xác định độ bền nhiệt của CPE amylase . .64
3.7.4. Xác định độ bền pHcủa CPE amylase . 65
ChuongIV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . .67
TÀI LIỆU THAM KHẢO . .69
PHỤ LỤC


http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-10-31-luan_van_nghien_cuu_thu_nhan_enzym_anpha_amylase.oATjOgDQVH.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-42860/
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

điều kiện chuẩn là 500C,
pH=6.
• Hoá chất
Dung dịch NaH2PO4 0,05M
Dung dịch Na2HPO4 0,05M
Dung dịch đệm phosphate 0,05M pH 6: trộn 87,7ml dung dịch NaH2PO4
0,05M và 12,3ml dung dịch Na2HPO4 0,05M thêm 100ml nước cất, đo lại pH.
Dung dịch tinh bột 1% pha trong pH 6: lấy 50ml dung dịch đệm phosphate
0,05M pH 6 đem đun sôi. Cân 1g tinh bột tan, hoà vào một ít đệm, khuấy đều,
đổ vào dung dịch đệm đang sôi, vừa khuấy vừa đun sôi trong 3 phút cho đến khi
dung dịch trong suốt. Định mức tới 100ml bằng dung dịch đệm.
Dung dịch iod: 1g I2 và 2g KI, thêm nước thành 100ml, bảo quản lạnh. Khi
dùng pha loãng 500 lần.
Dung dịch HCl 1N: 8,4ml HCl đậm đặc pha thành 100ml.
Dung dịch HCl 0,1N: pha loãng từ dung dịch HCl 1N.
• Tiến hành thí nghiệm
Dựng đường chuẩn tinh bột
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Tinh bột 1% (ml) 0 1 2 3 4 5
Dung dịch đệm (ml) 10 9 8 7 6 5
Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 0 1 2 3 4 5
- Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 5ml dung dịch I2KI đã
pha loãng 500 lần. Đem so màu ở bước sóng 560nm.
-Vẽ đồ thị tương quan giữa hàm lượng tinh bột và giá trị ΔOD.
Phản ứng enzym
Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống)
Tinh bột 1% (ml) 5 5
Dung dịch enzym (ml) 0,5 0
Để ổn nhiệt ở 500C, 10 phút
Dung dịch HCl 0,1N (ml) 5 5
Dung dịch enzym (ml) 0 0,5
- Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên, thêm vào mỗi ống 5ml dung
dịch I2KI đã pha loãng.
- Lắc đều, đem đo OD tại bước sóng 560nm.
• Công thức tính: hoạt độ α-amylase trong 1ml dịch enzym
HđA
vt
KVX
*
**
=
Trong đó: X: số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn.
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzym (10,5ml).
t: thời gian enzym phản ứng (10 phút).
v: thể tích enzym cho vào hỗn hợp phản ứng enzym (0,5ml).
K: hệ số pha loãng.
2.3.7. Các phương pháp nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu [5],
[12], [14], [20], [21], [45].
Khả năng sinh trưởng và sinh amylase không chỉ phụ thuộc vào chủng
giống VSV mà điều kiện nuôi cấy cũng ảnh hưởng rất nhiều. Do đó chúng tui
tiến hành các thí nghiệm sau để xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng
nghiên cứu sinh trưởng và sinh amylase tốt nhất.
2.3.7.1. Loại cơ chất
Tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn trong môi trường sinh tổng hợp
amylase có chất cảm ứng khác nhau: bột gạo, bột mỳ, bột bắp, tinh bột tan ở
nhiệt độ 37oC với chế độ lắc 200 vòng/phút. Sau mỗi mốc thời gian: 20h, 30h,
40h, 45h, 50h, 55h, 60h, 70h đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng, và ly tâm
loại bỏ sinh khối ở 5000 v/p trong 15 phút lấy dịch enzym để xác định hoạt độ
amylase theo phương pháp Heinkel. Chọn loại cơ chất và thời gian nuôi cấy
thích hợp thu amylase có hoạt độ cao nhất.
2.3.7.2. Nồng độ cơ chất
Nuôi chủng đã chọn trong môi trường sinh tổng hợp amylase có chứa loại
cơ chất thích hợp như đã xác định ở thí nghiệm 2.3.7.1 với nồng độ khác nhau:
0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% trên máy lắc với chế độ lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ
37oC. Sau thời gian tối ưu được xác định ở mục 2.3.7.1 đo OD620 xác định khả
năng sinh trưởng và đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Từ đó xác
định được nồng độ cơ chất tối ưu cho khả năng sinh amylase của chủng đang
nghiên cứu .
2.3.7.3. Nhiệt độ
Chủng đã chọn được nuôi trong môi trường sinh tổng hợp amylase có chứa
loại cơ chất với nồng độ thích hợp như đã xác định ở mục 2.3.7.1 và 2.3.7.2 ở
nhiệt độ khác nhau: 25 – 280C; 30 – 330C; 35 – 370C; 40 – 420C trên máy lắc
200 vòng/phút. Sau thời gian thích hợp đo OD620 xác định sự sinh trưởng và đo
hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Từ đó suy ra nhiệt độ tối ưu cho
chủng đang nghiên cứu sinh amylase.
2.3.7.4. pH ban đầu
Nuôi chủng đã chọn trên môi trường sinh tổng hợp amylase có các điều
kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở các thí nghiệm trên, với pH ban đầu khác
nhau: từ 5,0 đến 8,5 (mỗi bước nhảy là 0,5) trên máy lắc với chế độ 200
vòng/phút với thời gian thích hợp. Tiến hành xác định sự sinh trưởng và hoạt độ
amylase. Từ đó vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt độ amylase theo pH.
Suy ra pH ban đầu tối ưu cho chủng đã chọn sinh amylase.
2.3.7.5. Độ hiếu khí
Chủng vi khuẩn đã chọn được nuôi trong môi trường sinh tổng hợp
amylase với các điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở các thí nghiệm trên
trong các bình tam giác 500ml với dịch lên men có thể tích khác nhau : 50, 75,
100, 150, 200, 250, 300ml trên cùng máy lắc với chế độ 200 vòng/phút, cùng
thời gian thích hợp. Xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase, kết quả thí
nghiệm này cho phép xác định được tỉ lệ thể tích dịch lên men và thể tích bình
nuôi cấy tối ưu để thu được hoạt độ amylase cao nhất.
2.3.7.6. Ảnh hưởng của các loại muối
• Nồng độ NaCl
Nuôi chủng đã chọn trong môi trường cảm ứng sinh amylase với các điều
kiện tối ưu, có nồng độ muối NaCl thay đổi: 0; 0,03; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12% trên
cùng máy lắc với chế độ 200 vòng/phút . Sau thời gian thích hợp xác định khả
năng sinh trưởng và hoạt độ amylase. Suy ra nồng độ NaCl tối ưu cho khả năng
sinh amylase.
• Nồng độ CaCl2
Chủng nghiên cứu được nuôi trong môi trường cảm ứng có nồng độ muối
CaCl2 khác nhau: 0; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025% trên máy lắc 200 vòng/phút và
các điều kiện nuôi cấy tối ưu đã xác định ở các thí nghiệm trên. Sau thời gian
phù hợp đo khả năng sinh trưởng và hoạt độ amylase. Từ đó kết luận được nồng
độ CaCl2 tối ưu để sinh amylase có hoạt độ cao.
2.3.7.7. Nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng
Nuôi chủng đã chọn trên môi trường MPA có nồng độ muối NaCl khác
nhau: từ 1% đến 7% (mỗi bước nhảy 1%) với điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp
trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau thời gian sinh trưởng tối ưu như đã xác định ở
mục 2.3.7.1 tiến hành đo pH và sự sinh trưởng OD620, so sánh với pH và OD620
của môi trường MPA. Từ đó xác định được nồng độ NaCl cao nhất ức chế sự
sinh trưởng của chủng nghiên cứu.
2.3.8. Phương pháp phân loại để xác định loài của chủng đã tuyển chọn [20]:
sử dụng kỹ thuật PCR
 Nguyên tắc: Khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi
chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
• Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao
chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94-
950C trong vòng 30s-1phút.
• Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt
độ này dao động trong khoảng 40-700C và kéo dài 30s-1phút.
• Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 720C để DNA polymerase
hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của
trình tự DNA, thường kéo dài từ 30s đến vài phút.
 Giải trình tự các axit nucleic
Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2
nguyên tắc:
• Nguyên tắc hoá học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản
ứng thuỷ giải hoá học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân
đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotide.
• Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và các phương pháp...

---