Download miễn phí Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ
Đối tượng nghiên cứu
- Nấm sợi sinh enzym cellulase phân lập từRNM Cần Giờ.
- Các VSV kiểm định: E. coli, Bacilllus subtilis được cung cấp từ
Viện Pasteur.
Hóa chất
- Các hóa chất có nguồn gốc từViệt Nam: Glucose, dầu DO, pepton,
cazêin, kitin, tinh bột tan, agar, cồn đốt, nước cất, nước biển.
- Các hóa chất có nguồn gốc từTrung Quốc: K2HPO4, KH2PO4., KCl,
NaCl, NaOH, NaNO3, MgSO4. 7H2O, FeSO4.7H2O, HgCl2, Na-acetate, lugol,
lactophenol, xanh metylen Loeffler .
- Hóa chất có nguồn gốc từ Đức: thuốc thửDNS, Yeast extract, .
- Hóa chất có nguồn gốc từNhật Bản: CMC, muối Tartrat K Natri
Cách pha chếthuốc thửDNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid) [32].
- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic: Cân 10g DNS cho vào
becher (cốc thủy tinh) 1000ml, thêm 400ml nước cất, đặt becher vào nước
80độ C, khuấy đều. Thêm dung dịch NaOH (16g NaOH trong 150 ml nước cất)
từtừvào dung dịch DNS, khuấy ởnhiệt độ80 độ C.
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-10-31-luan_van_nghien_cuu_kha_nang_sinh_enzym_cellulase.vXLBRZinNt.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-42855/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
1 g (vết)
- CMC : 10 g
- Agar : 20 g
- Nước biển : 1000ml
- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút
MT 6: MT thử hoạt tính protease [10]
- NaNO3 : 3,5 g
- K2HPO4 : 1,5 g
- MgSO4.7H2O : 0,5 g
- KCl : 0,5 g
- FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết)
- Cazêin : 15 g
- Agar : 20 g
- Nước biển : 1000ml
- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút
MT 7: MT thử hoạt tính amylase [47]
- NaNO3 : 3,5 g
- K2HPO4 : 1,5 g
- MgSO4.7H2O : 0,5 g
- KCl : 0,5 g
- FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết)
- Tinh bột tan : 15 g
- Agar : 20 g
- Nước biển : 1000ml
- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút
MT 8: MT thử hoạt tính kitinase [22]
- NaNO3 : 3,5 g
- K2HPO4 : 1,5 g
- MgSO4.7H2O : 0,5 g
- KCl : 0,5 g
- FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết)
- Bột kitin : 10 g
- Agar : 20 g
- Nước biển : 1000ml
- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút
* Cách chiết kitin từ vỏ, đầu tôm
- Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô.
- Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70-750C/ 4 giờ, sau đó
rửa sạch bằng nước cất.
- Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 26- 300C/ 16 giờ, rửa sạch.
- Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh.
MT 9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [29]
- KH2PO4 : 0,3 g
- MgSO4 : 0,4g
- KNO3 : 3 g
- Na2HPO4 : 0,7 g
- Nước biển : 1000ml
- Dầu DO : 5ml
- pH = 5,5- 6,0. Khử trùng ở 1atm/ 30 phút
MT nuôi cấy nấm sợi tạo enzym
MT 10: MT xốp cơ sở [18], [30]
- Cám : 60%
- Bột đậu nành : 30%
- Bột ngô : 10%
- Trấu : bổ sung thêm 25%
- Độ ẩm : 60%
- pH = 5,0 – 5,5. Khử trùng 1atm/ 60 phút
MT nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định
MT 11 : MT Meat pepton agar (MPA) [27]
- Pepton : 5g
- NaCl : 5g
- Cao thịt : 5g
- Agar : 20g
- Nước cất : 1000 ml
- pH= 7,5. Khử trùng 1atm/ 30 phút
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ [58]
Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã
Tam Thôn Hiệp, xã An Thới Đông, xã Long Hòa, xã Bình Khánh, Lâm
Viên….Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2 km, các điểm lấy mẫu
cách nhau khoảng 200m. Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ
(hình 2.1). Lấy mẫu phân lập trong 3 tháng (tháng 7, 8, 9), mỗi tháng lấy mẫu
một lần. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ có độ mặn 30 ‰ , nhiệt độ khoảng
290C, pH 7,6.
Hình 2.1. Vị trí lấy mẫu ở RNM Cần Giờ
Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5- 10 cm, lá vàng sắp rụng, lá
rụng bị mục, thân cành chết khô còn trên cây, thân cành chết đang bị phân
hủy trên mặt đất.
Cách lấy: Dùng dao, kéo vô trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi
nilon vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản
trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C. Các mẫu
được phân lập ngay không giữ quá 24 giờ.
2.2.2. Phương pháp vi sinh
2.2.2.1. Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo
Uyenco, 1988 [58], [78]
a- Lấy mẫu và pha loãng mẫu
Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển
Cần Giờ vô trùng.
Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/
phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngoài.
Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1.
Lắc đều, rồi hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml
nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2.
Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5.
b- Cấy mẫu
Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa MT1, MT2,
MT3. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đó sử dụng que trang đó
trải tiếp hai đĩa tiếp theo.
c- Ủ mẫu
Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo cũ, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3 – 7
ngày. Chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng.
d- Làm thuần
Lấy một KL riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước biển vô
trùng, trải lên đĩa lần hai. Nếu các dạng KL đồng đều, có màu sắc giống nhau,
soi dưới KHV đều có một dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết.
Sau đó chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo
quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái sinh lí, sinh hóa.
2.2.2.2 Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên MT thạch có
lớp dầu khoáng [6]
Dầu khoáng là parafin hay vaselin, hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi
sấy khô ở 1700C trong 1- 2 giờ, để nguội.
Chuẩn bị 3 ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp.
Đổ lớp dầu khoáng đã vô trùng lên bề mặt. Hàn kín ống nghiệm bằng parafin
bảo quản ở nhiệt độ 40C.
Phương pháp này có thể bảo quản trong 1- 3 năm.
2.2.2.3. Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi [5], [6], [11]
Nấm sợi sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo khuẩn
lạc (KL) lớn theo các bước sau:
- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng.
- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào
ống nghiệm. Lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm
điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2,3 hộp.
- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL. Hàng ngày lấy ra quan sát.
Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm:
+ Kích thước KL để biết tốc độ phát triển của nó.
+ Hình dạng KL.
+ Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc.
+ Màu sắc của MT do sắc tố nấm sợi tạo ra.
+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT.
+ Đặc điểm của mép KL.
+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL…….
2.2.2.4. Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi [6]
Phương pháp cấy khối thạch của J.T.Dunean
- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong
các đĩa petri.
- Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8 mm, khoan các khối thạch.
- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước,
nước cất vô trùng.
- Đặt 1 hay 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề
xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt các khối thạch.
- Các phiến kính có khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu được đặt trong
các hộp petri có sẳn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô
trùng. Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày.
- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc
nhuộm lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất.
- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt
lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta được tiêu bản thứ hai.
- Dùng kính hiển vi (KHV) quan sát, vẽ và mô tả các đặc điểm:
+ Hình dạng cuống sinh bào tử.
+ Hình dạng thể bình.
+ Hình dạng các thể bọng.
+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn.
+ Đặc điểm bào tử đính.
+ Màu sắc, kích thước bào tử…
- Chụp hình trên KHV quang học ở độ phóng đại 400-1000 lần.
2.2.2.5. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase
[3], [22], [29], [34],[36], [40], [42]
a. Nguyên tắc
Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẳn trong MT để sinh trưởng tạo
thành một lượng lớn enzym ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối
nấm sợi lẫn enzym thô.
b. Cách tiến hành
Nấm sợi được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng ch
