Download miễn phí Luận văn Xây dựng qui trình phát hiện escherichia coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và thử nghiệm ứng dụng
Để có nguồn chủng E. coliphục vụ việc xây dựng qui trình phát hiện E. colivà đánh giá
hiệu lực qui trình, bên cạnh hai chủng E. colichuẩn được cung cấp từ Đại học RMIT (Úc) và
viện Pasteur TP. HCM, chúng tôi đã tiến hành phân lập E. colitừ khoảng 67 mẫu thực phẩm
khác nhau như thịt, cá, trứng, sữa, rau quả, gia vị và sản phẩm khô. theo phương pháp nuôi cấy
truyền thống. Mẫu được tăng sinh chọn lọc trong các ống môi trường BGBL chứa ống Durham ở
44độ C trong 24 giờ. Các ống môi trường có lên men và sinh hơi (đục, có bọt khí trong ống
Durham) (Hình 7) được dùng để cấy lên các đĩa petri chứa môi trường EMB nhằm mục đích
tách và phân lập khuẩn lạc đặc trưng của E. Coli. Sau 24 giờ ủ ở nhiệt độ 37độC ở đĩa petri từ các
mẫu chứa E. coliđã xuất hiện các khuẩn lạc màu đỏ tía, có ánh kim, bờ tròn đều và đường kính
khoảng 0,5mm (Hình 8)
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-10-31-luan_van_xay_dung_qui_trinh_phat_hien_escherichia.XIxDm6Uiku.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-42873/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
ần của phản ứng; sự xuất hiện những sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao
vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau... Ngoài ra, số chu kỳ
cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu.
4.3. Ưu nhược điểm của phư ơng p háp PCR để phát hiện v i sinh vật tr ong th ực ph ẩm
[10,18]
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Phương pháp PCR giúp phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm một cách nhanh
chóng và tin cậy. Ưu điểm của phương pháp này là thời gian cho kết quả nhanh, ít tốn kém về
mặt nhân sự, có thể nhận diện được những sinh vật khó nuôi cấy, việc nuôi cấy tăng sinh là đơn
giản hơn và có khi không cần thiết. Ngoài ra, hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ
tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học và không cần công cụ và môi trường chẩn đoán
phức tạp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như:
- Sự ức chế hoạt tính của Taq DNA polymerase bởi thành phần phức tạp của mẫu thực
phẩm. Mặc dù vậy việc tách chiết và tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường trước khi thực
hiện phương pháp PCR cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế.
- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thường thấp, nên trong đa số trường
hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR.
- Phương pháp PCR không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết. Do vậy có thể dẫn
đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép
phát hiện bào tử dạng tiềm sinh, hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hay gây ngộ
độc.
Một giải pháp chung đối với các nhược điểm trên là kết hợp một bước tăng sinh ngắn và
một bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường nuôi cấy và rửa tế bào trước khi tiến hành phản
ứng PCR.
4.4. Các nghi ên c ứu ứng dụng PCR tr ong phát h iện vi sinh v ật trong thực pha åm [10]
Hiện nay, có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để
phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, bệnh phẩm hay những loài
khó nuôi cấy. Việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp PCR cần
phải qua bước nuôi cấy tăng sinh chọn lọc vi sinh vật cần phát hiện trước khi tách chiết DNA để
thực hiện phản ứng PCR. Sau khi nuôi cấy tăng sinh, tiến hành thu tế bào từ dịch tăng sinh để
tách chiết DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu ứng dụng
kĩ thuật PCR trong việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tại Trung tâm Khoa học
và Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM đã thiết lập
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
được một số bộ kit phát hiện một số loài gây bệnh khác trong thực phẩm như Samonella,
Shigella…bằng PCR [10]
5. XÁC NH ẬN H IỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP [20, 21]
5.1. Định nghĩa
Xác nhận hiệu lực (validation) là quá trình thực hiện để củng cố một mục đích sử dụng,
thực hiện một qui trình hay một phương pháp bằng những thí nghiệm kiểm tra và cung cấp
những chứng cứ khách quan về những kết quả thu được. Xác nhận hiệu lực một phương pháp
phân tích vi sinh mới (hay phương pháp thay thế, alternative method) là quá trình thực nghiệm
để so sánh những kết quả thu được từ phương pháp thay thế và kết quả thu được so vớiø phương
pháp tiêu chuẩn (phương pháp tham chiếu, reference method) cho cùng mục đích sử dụng.
Qui trình xác nhận hiệu lực của phương pháp thay thế thường gồm 2 bước:
- Xác nhận hiệu lực sơ cấp (primary validation): bước này do phòng thí nghiệm đề xuất
phương pháp mới tiến hành nhằm đưa ra các thông số kĩ thuật của phương pháp để chứng minh
rằng phương pháp này có chức năng tương đương hay có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp
tiêu chuẩn.
- Xác nhận hiệu lực thứ cấp (secondary validation): bước này nhằm thẩm tra các thông số
kĩ thuật trong bước xác nhận hiệu lực sơ cấp đồng thời xác nhận độ lặp lại (repeatability), độ tái
lập (reproducibility), độ lệch chuẩn (standard deviation) của phương pháp thay thế. Bước này
được tiến hành bởi nhiều phòng thí nghiệm khác nhau dưới sự chủ trì của một cơ quan có chức
năng. Kết quả xác nhận hiệu lực thứ cấp sẽ được trình lên hội đồng quốc gia hay các tổ chức
quốc tế có thẩm quyền ban hành phương pháp để xem xét, đánh giá và ban hành phương pháp
trở thành một phương pháp chính thức.
5.2. Các thông số kĩ thuật trong xác nhận h iệu lư ïc phương pháp
Độ chính xác (accuracy): là thông số đánh giá khả năng cho kết quả chính xác của
phương pháp thay thế so với phương pháp tham chiếu. Độ chính xác của phương pháp thay thế
biểu thị bằng tỉ lệ cho kết quả dương hay âm tính trên các mẫu có kết quả dương tính hay âm
tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu.
- Độ đúng (precision): là mức độ thống nhất giữa những kết quả kiểm tra độc lập của
những lần phân tích khác nhau từ một mẫu chung. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ tái lặp.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
- Độ lặp lại (repeability): là mức độ thống nhất giữa các kết quả từ những lần khảo sát
độc lập trên một mẫu xác định ở trong cùng một điều kiện thực hiện về qui trình, thiết bị, người
thực hiện, tại cùng một thời điểm.
- Độ tái lặp (reproducibility): là mức độ thống nhất giữa các kết quả từ nhiều lần phân
tích khác nhau trên một mẫu xác định bằng phương pháp phân tích nhưng được thực hiện tại các
phòng thí nghiệm khác nhau, thời gian, điều kiện thực hiện và người phân tích khác nhau.
- Độ ổn định (robustness): là khả năng duy trì tính ổn định của kết quả phân tích khi các
điều kiện thực hiện có sự thay đổi nhỏ. Độ ổn định cho biết giới hạn thay đổi cho phép của các
thành phần tham gia vào qui trình phân tích và cung cấp thông tin về độ tin cậy của phương pháp
trong quá trình sử dụng.
- Độ nhạy (sensitivity): là chỉ số đánh giá khả năng phát hiện vi sinh vật mục tiêu có
trong mẫu của phương pháp thay thế. Chỉ số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so
với số kết quả dương tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu.
- Độ đặc hiệu (specificity): là khả năng phương pháp đó cho kết quả âm tính trên mẫu
phân tích không chứa vi sinh vật mục tiêu (được kiểm chứng bằng phương pháp tham chiếu). Chỉ
số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so với số kết quả âm tính khi phân tích bằng
phương pháp tham chiếu.
- Âm tính giảû (false negative): là kết quả âm tính khi phân tích một mẫu chắc chắn chứa
vi sinh vật mục tiêu.
- Dương tính giả (false positive): quả dương tính khi phân tích mẫu chắc chắn không chứa
vi sinh vật mục tiêu.
- Giới hạn phát hiện: là mật độ tế bào vi sinh vật thấp nhất mà một phương pháp phân
tích có thể phát hiện được. Tại giới hạn phát hiện, số lần p...
