Download miễn phí Luận văn So sánh tác dụng thủy phân đậu hũ bằng phức hệ enzyme của Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp.để chế biến thức uống chức năng



Định lượng bào tử Bacillus subtilis sp. trong sản phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn
lạc [17]
Nguyên tắc
Cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù vi sinh vật cấy lên môi trường thạch có thành phần
cơ chất đặc trưng và thích hợp cho loài vi sinh vật cần định lượng phát triển. Sau một khoảng thời
gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể
tích mẫu đã cấy và hệ số pha loãng, ta có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu khảo sát ban
đầu.
Cách tiến hành
- Xác định bào tử có trong sản phẩm
Nhuộm bào tử: bào tử của Bacillus subtilis sp. có màu hồng, thường nằm giữa tế bào có màu
xanh.
- Khử trùng mẫu theo kiểu Pasteur là biện pháp hấp nóng nguyên liệu một lần ở nhiệt độ thấp
hơn 100oC. Nhiệt độ và thời gian khử trùng theo kiểu Pasteur tùy thuộc vào sức đề kháng của vật
liệu đối với nhiệt độ.
Đun nóng dịch tế bào thu được từ các thí nghiệm trên ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút.
- Pha loãng dịch huyền phù bào tử ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3
Tiến hành cấy
0,1 ml dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào các đĩa Petri môi trường NA đã được đổ sẵn.
Đặt các đĩa thạch vừa cấy ở nhiệt độ phòng và ủ trong 24 giờ.
- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng bào tử
trong 1 ml mẫu. Thí nghiệm lặp lại 2 lần.

Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966). Hoạt tính
amylase biểu thị khả năng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50oC và
được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme đó trong một gam mẫu.
Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa bị phân hủy sẽ tạo phản
ứng với iod và được đo bằng máy so màu quang học.
công cụ và hóa chất
- Máy đo quang phổ.
- Bể ổn nhiệt.
- Dung dịch đệm phosphate (pH 6,2)
+ Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M: 27,8 g Na2HPO4 hòa tan, dẫn nước đến 1000
ml (dung dịch a).
+ Dung dịch dinatri hydrophosphate: 53,05 Na2HPO4.7H2O hay 71,1 g Na2HPO4.12H2O
hòa tan dẫn nước đến 1000 ml (dung dịch b).
+ Để chỉnh pH = 6,2: 81,5 ml dung dịch a + 18,5 ml dung dịch b.
- Dung dịch tinh bột 1%: 1 g tinh bột tan, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 50 ml nước
cất, lắc đều trong bể cách thủy 10 – 15 phút, đến khi tinh bột tan hoàn toàn, thêm 10 ml dung dịch
đệm phosphate 6,2. Thêm nước cất cho đủ 100 ml.
- Dung dịch Lugol: 0,5 g Iod + 5 g KI, thêm nước cất cho đủ 200 ml.
- Dung dịch HCl 1N: hòa tan 85 ml dung dịch HCl đậm đặc trong nước cất cho vừa đủ 1 lít.
- Dung dịch NaCl 3%: cân 3 g NaCl hòa tan với nước cất cho đủ 100 ml.
Tiến hành
Dùng các ống nghiệm có đánh dấu sẵn và tiến hành cho vào các ống nghiệm các dung dịch
và hóa chất
Ống chuẩn Ống thử
1 ml nước cất 1 ml dịch enzyme các mẫu
1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml đệm phosphate pH 6.2
1 ml dung dịch tinh bột 1% 1 ml dung dịch tinh bột 1%
0,5 ml dung dịch NaCl 3% 0,5 ml dung dịch NaCl 3%
Đem ủ ở 50oC trong 30 phút, sau đó cho mỗi ống 1 ml dung dịch HCl 1N để kìm hãm sự hoạt
động của enzyme. Cho nước cất đến 10 ml mỗi ống. Cho tiếp một giọt dung dịch Lugol vào mỗi
ống. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm.
Đơn vị hoạt tính của enzyme amylase được tính theo công thức:
UI=
mta
LCba
**
**)( 
a: mật độ quang học của ống chuẩn.
b: mật độ quang học của ống thử.
C: lượng tinh bột ban đẩu tham gia phản ứng (10mg).
L: hệ số pha loãng
m: trọng lượng (g) hay thể tích (ml) mẫu.
* Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease [11]
Nguyên tắc
Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở
định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.
Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới
tác dụng enzyme.
công cụ hóa chất
- Ống nghiệm. - HCl 0,1M.
- Bể ổn nhiệt. - NaCl 2M.
- Máy đo quang phổ. - NaOH 0,1N.
- Giấy lọc. - H3PO41/30M.
- Dung dịch trichloroacetic 5%. - Na2CO3 0,4M.
- Dung dịch đệm phosphat pH = 6,2. - Ca(CH3COOH)2 0,2M.
- Tyrosin tinh khiết. - Dung dịch casein 1%.
- Thuốc thử Folin.
Tiến hành
 Dựng đường chuẩn
Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 g tyrosin /1 ml HCl
0,1M. Thêm 5 ml Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm
1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều để ổn định dung
dịch ở 37±0,50C trong 20 phút.
Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả AS10, AS20, AS30, AS40,
AS50.)
Ống đối chứng: dùng 1ml HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước
sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này AS0).
Dựng đường chuẩn theo hàm lượng g tyrosin và độ hấp thụ:
5
5040302010
050040030020010 SSSSSSSSSS AAAAAAAAAAF










 Định lượng enzyme trong mẫu
Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37±0,50C trong 15 phút. Sau
thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào, lắc đều, ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ 37±0,50C trong 60
phút. Sau đó cho vào hỗn hợp này 2 ml dung dịch trichloroacetic (TCA) 5%. Để ổn định nhiệt trong
25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5ml dung dịch Na2CO3vào 1 ml dịch
lọc. Cho thêm thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào hỗn hợp, để yên ở 37±0,50C trong 20 phút.
Khi xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm.
Mẫu đối chứng: lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước
tương tự ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện.
Tính kết quả
Một đơn vị hoạt tính enzyme protease chính là lượng enzyme tạo amino acid tương đương
100 µg tyrosin trong 1 ml dịch lọc trong điều kiện thí nghiệm.
Hoạt tính enzyme protease:
ĐVHT/g hay ml dung dịch enzyme= (A60 – A0)*F*n*1/100
A60: độ hấp thụ của mẫu.
A0: độ hấp thụ của mẫu đối chứng.
F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước
sóng 660nm trên đường chuẩn.
n: hệ số pha loãng mẫu.
1/100: hệ số chuyển đổi.
2.2.5.2. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme của BsTC và Bn
Có ba yếu tố cần khảo sát: thời gian, nhiệt độ và pH vì đây là một trong những yếu tố có ảnh
hưởng nhiều đến hoạt tính hệ enzyme của vi khuẩn.
* Yếu tố thời gian
- Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất
đậu hũ tại cùng thời điểm.
- Ủ ở nhiệt độ phòng lần lượt theo các mốc thời gian: 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40
giờ.
- Xác định hoạt tính enzyme ở các mốc thời gian trên.
* Yếu tố nhiệt độ
- Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất
đậu hũ tại cùng thời điểm.
- Ủ mẫu ở các nhiệt độ: 15, 20, 25, 30, 35, 40, 450C trong 24 giờ, pH cơ chất.
- Xác định hoạt tính enzyme ở các mốc nhiệt độ trên.
* Yếu tố pH
- Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất
đậu hũ tại cùng thời điểm.
- Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ với pH lần lượt là 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.
- Xác định hoạt tính enzyme các mẫu trên.
2.2.5.3. Tối ưu hóa điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của BsTC và Bn [1]
Chúng tui bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với ba yếu tố thời gian, nhiệt độ, pH
vì đây là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của BsTC , Bn.
Yếu tố không đổi trong quá trình khảo sát là cơ chất đậu hũ và tỉ lệ giống cấy 1% (v/w).
Số thí nghiệm tối ưu 23 = 8, ngoài ra còn có thêm 3 thí nghiệm ở tâm để kiểm tra ý nghĩa các
hệ số của phương trình hồi quy.
Ba yếu tố cần khảo sát:
- X1 là yếu tố thời gian với các giới hạn được xác định sau khảo sát ở trên.
- X2 là yếu tố nhiệt độ với các giới hạn được xác định sau khi khảo sát ở trên.
- X3 là yếu tố pH với các giới hạn được xác định sau khi khảo sát ở trên.
Hàm mục tiêu Y là hoạt tính enzyme được tính sau đo OD595 (amylase) hay OD660
(protease).
Bảng 2.1. Bố trí quy hoạch thực nghiệm
Mẫu thí nghiệm X1 X2 X3 Y
1 + + +
2 + + -
3 + - +
4 + - -
5 - + +
6 - + -
7 - - +
8 - - -
9 0 0 0
10 0 0 0
11 0 0 0
Ghi chú: (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên.
2.2.6. Quy trình công nghệ lên men đậu hũ chế biến thức uống chức năng
Hình 2.3. Quy trình công nghệ thủy ...

Link mới update:
So sánh tác dụng thủy phân đậu hũ bằng phức hệ enzyme của Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp.để chế biến thức uống chức năng

---