́

ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀNÔỊ
TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TƢC̣NHIÊN

-----------------------

THÂN VĂN MINH

ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PHEROMONE LAI
ALPHA (MF(ALPHA)1) Ở CÁC CHỦNG Pichia pastoris TÁI TỔ
HỢP SINH AMYLASE VÀ INTERLEUKIN-2 BẰNG KỸ THUẬT
REAL-TIME PCR

LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨKHOA HOCC̣

Hà Nội –Năm 2012
i


́

ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀNÔỊ
TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TƢC̣NHIÊN

-----------------------

THÂN VĂN MINH

ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PHEROMONE LAI
ALPHA (MF(ALPHA)1) Ở CÁC CHỦNG Pichia pastoris TÁI TỔ

bảotậntìnhvềchuyênmôn,sựđộngviênquýbáucủa TS. Lê Thị Thu Hồng, TS. Dương
Cẩm Thúy,ThS.NguyễnHồngThanh, CN. Trần Nhật Anhvàcác
tạiphòngKỹthuậtDitruyền–ViệnCôngnghệsinh

học,ViệnKhoa

vàCôngnghệViệtNam.Nhândịphoànthànhluậnvăn này,tôixin

anh chị
học
bàytỏlòng

biếtơnsâusắccủamìnhtới sựgiúpđỡvôcùngquýbáuđó.
Tôicũngxintrântrọngcảmơncácthầy

giáo,côgiáotrongKhoaSinhhọc-

TrƣờngĐạihọcKhoa họcTựnhiên,ĐạihọcQuốcgiaHàNội,đãtậntìnhgiảngdạy, dìudắt
tôi trongthờigianhọctậptạitrƣờng.
Cuốicùng,tôixingửilờicảmơnđếnngƣờithântronggiađìnhvàbạnbè

đã

độngviênvàgiúpđỡtôi trongsuốtthờigianhọctậpvànghiêncứuvừaqua.
Xin chânthànhcảmơn!
HàNội,ngày12tháng12năm2012
Họcviên

Thân Văn Minh


Ethylenediaminetetraaceticacid

IL-2

Interleukin-2

kDa

Kilodalton

LB

Luria-Bertanimedium

MCS

Multicloningsite

PCR

PolymeraseChainReaction

PDB

Proteindatabank

PDF

ProbabilityDensityFunction


1.1.2. Những ƣu điểm của hệ biểu hiện P. pastoris....................................... 5
1.1.3. Quá trình chuyển hóa methanol ở P. pastoris....................................... 7
1.1.4. Cơ chế tiết protein ở nấm men.............................................................. 8
1.1.5. Vector biểu hiện gene ngoại lai của P. pastoris................................... 10
1.2. Tổng quan về α-factor và geneMF(ALPHA)1............................................ 12
1.3. Tổng quan về các protein ngoại lai trong đề tài......................................... 15
1.3.1. Tổng quan về Interleukin-2................................................................ 15
1.3.2. Tổng quan về α-amylase:.................................................................... 17
1.4. Kỹ thuật Real-time PCR............................................................................ 18
1.4.1. Tổng quan về Real-time PCR............................................................. 18
1.4.2. Phân tích kết quả Real-time PCR....................................................... 21
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.................................................... 24
2.1. Vật liệu...................................................................................................... 24
2.1.1. Chủng vi sinh vật và các gene biến nạp.............................................. 24
2.1.2. Mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR......................................... 24
2.1.3. Hóa chất, enzyme và các thiết bị máy móc......................................... 24
2.1.4. Phần mềm........................................................................................... 25
2.1.5. Các loại môi trƣờng và dung dịch...................................................... 25
2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................... 27
2.2.1. Phƣơng pháp lên men và nuôi cấy các chủng P. pastoris tái tổ hợp...27
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch mRNA từ P. pastoris................27
2.2.3. Kỹ thuật PCR..................................................................................... 29
2.2.4. Kỹ thuật Real-time PCR..................................................................... 30
2.2.5. Xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0..............................31
iii


CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 33
3.1. Lên men các chủng P. pastoris tái tổhợp................................................... 33
3.2. Tách chiết và tinh sạch RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men....36

bình.......................................................................................................................... 52
Bảng 3.6: Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một
chủng P. pastoris mang gene mã hóa cho interleukin-2 theo giá trị chu kỳ ngƣỡng
trung bình................................................................................................................ 52

v


MỤC LỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Hình thái của nấm men P. pastoris............................................................3
Hình 1.2: Con đƣờng chuyển hóa methanol trong nấm men P. Pastoris...................8
Hình 1.3: Sơ đồ khái quát quá trình phân khu các protein ở sinh vật nhân chuẩn .. . .9
Hình 1.4: Bản đồ vector biểu hiện pPIC9................................................................ 11
Hình 1.5 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí his4............................................................ 12
Hình 1.6: Thiết kế tạo các chủng nấm men P. pastoris tái tổ hợp ...........................14
Hình 1.7 : Cấu trúc không gian của IL-2................................................................. 16
Hình 1.8: Sơ đồ tiến hành phản ứng Realtime-PCR................................................ 20
Hình 1.9: Biểu đồ một đƣờng biểu diễn khuếch đại ghi nhận cƣờng độ huỳnh
quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận đƣợc ánh sánh kích thích vào mỗi chu kỳ
nhiệt......................................................................................................................... 22
Hình 1.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy cho phép xác định Tm nhờ các đỉnh biểu đồ
chảy của từng ống phản ứng.................................................................................... 23
Hình 3.1: Các chủng P. pastoris tái tổ hợp nuôi cấy trên môi trƣờng MD đặc........33
Hình 3.2: Biểu đồ sinh trƣởng của các chủng P. Pastoris theo thời gian.................34
Hình 3.3: Kết quả điện di kiểm tra protein ngoại lai đƣợc biểu hiện ở các chủng
P. Pastoris mang gene ngoại lai tại các thời điểm lấy mẫu khác nhau.....................35
Hình 3.4: Kết quả điện di RNA tổng số tại các thời điểm ở lần lên men thứ 1........37
Hình 3.5. Điện di mẫu RNA tổng số trƣớc và sau khi xử lý loại DNA...................38
Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA................39
Hình 3.7: Kết quả Real-time PCR với gene chuẩn IPP1.......................................... 42

nhân sơ nhƣ E.coli, Bacillus… hay sinh vật nhân chuẩn nhƣ Nấm men
Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris … hay các tế bào bậc cao nhƣ tế bào côn
trùng hay tế bào động vật [3].
Nấm men P. pastoris đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu biểu hiện gen
ngoại lai, đến nay đã có hơn 200 loại protein đƣợc biểu hiện trong P. pastoris. Với
chủng nấm men này, nhiều protein ngoại lai đƣợc tạo ra với hàm lƣợng lớn có thể
đạt trên 10g/l, tuy nhiên một số protein lại đƣợc biểu hiện ở mức độ thấp (dƣới 1
mg/l), hoặc không xác định đƣợc. Để nâng cao khả năng biểu hiện của protein, một
số phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng nhƣ: thay thế mã bộ ba cho phù hợp, biểu hiện
đồng thời với chaperone hoặc với các protein khác, gây đột biến một số gen của
chủng biểu hiện tối ƣu điều kiện nuôi cấy … Tuy nhiên không phải tất cả các
trƣờng hợp đều thành công do những hiểu biết về di truyền phân tử và quá trình lý
hóa trong chủng nấm men này vẫn còn hạn chế.
Những kết quả phân tích so sánh hệ transcriptome của chủng P. pastoris đối
chứng, chủng sinh tổng hợp interleukin-2, chủng sinh tổng hợp amylase sử dụng
YEAST_2 array, bao gồm khoảng 12.000 bô C̣mâũ dòđăcC̣ hiêụ cho các gen trong hê C̣
genome của S. cerevisiae và Schizosaccharomyces pombe cho thấy có 6 gene có sự
khác biệt trong biểu hiện gen giữa các chủng nghiên cứu trong đó có gene mã hóa
pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1 [15].
1


GeneMF(ALPHA)1 mã hóa cho α-factor có vai trò trong sinh sản của nấm
men. Gene(MF(ALPHA)1 không có mặt trong chủng P. pastoris gốc ban đầu,
nhƣng trong vector biểu hiện pPIC9, đƣợc đƣa vào các chủng nấm men P. pastoris
trong quá trình tạo chủng tái tổ hợp. Cho đến nay chƣa có nghiên cứu nào thông
báo về mối liên hệ giữa sự biểu hiện của gen ngoại lai và gene(MF(ALPHA)1 trong
các hệ biểu hiện.
Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của gene(MF(ALPHA)1 trong các chủng
nghiên cứu sẽ đƣợc đánh giá bằng kỹ thuật Real-time PCR với mồi đặc hiệu. Đây là


3


Bảng 1.1: Các chủng biểu hiệnP. Pastoris
Tên chủng
X-33
GS115
KM71H
GS115/Albumin
MC100-3
SMD1168
SMD1165
Hầu hết các chủng mang đột biến ở genedehydrogenase histidinol (his4) để
cho phép lựa chọn các vector biểu hiện chứa his4 khi biến nạp. khi DNA plasmid
đƣợc biến nạp vào nấm men, ta thƣờng nhận đƣợc các chủng tái tổ hợp thƣờng có
+

s

-

+

ba kiểu hình: Mut , Mut , Mut [10, 12]. Chủng có kiểu hình Mut phát triển tốt
trong môi trƣờng chứa methanol nhƣ chủng dại (X-33 và GS115). Chủng bị đột
s

biến mất geneAOX1 có kiểu hình Mut , còn chủng bị đột biến mất cả hai geneAOX
-

biến sau dịch mã, nên loại protein đƣợc biểu hiện bị giới hạn, đặc biệt là protein có
nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn [18]. Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp
trong E. coli phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm cấu trúc của protein muốn biểu hiện.
Khi protein muốn biểu hiện ở dạng tan nếu việc tạo cấu trúc bậc cao bị lỗi sẽ dẫn tới
việc tạo thành các thể vùi nên yêu cầu có bƣớc làm tan và tái gấp nếp để có protein
có đúng cấu trúc mong muốn tuy nhiên việc này không hề dễ dàng, tiêu tốn nhiều
thời gian, dẫn tới việc giảm nồng độ sản phẩm và tăng giá thành biểu hiện. E. coli
thƣờng không phù hợp cho những nghiên cứu biểu hiện protein có cầu nối
disulphide cao hoặc những protein yêu cầu có sự cải biến sau dịch mã nhƣ:
glycosyl, phosphoryl hóa, lipid hóa, tạo cầu disulphide, sunfat hóa… Do đó, protein
tái tổ hợp đƣợc tạo ra từ E. coli có thể bị thay đổi chức năng. Trong trƣờng hợp đó
những hệ thống biểu hiện eukaryote nhƣ S. cerevisiae, P. pastoris… đƣợc ƣu tiên
sử dụng[41].
Đối với S. Cereviasiaetuy có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã của
eukaryote nhƣng thƣờng có sự glycosyl hóa quá mức với chiều dài chuỗi
carbonhydrate gắn vào protein rất lớn từ 50-150 phân tử mannose. Điều này làm
tăng cao khối lƣợng phân tử của protein và đồng thời gây nên tính kháng nguyên ở
các protein tái tổ hợp. Ngoài ra, quá trình N-glycosyl hóa ở S.cerevisiae luôn có
chứa các liên kết α-1,3 glycan ở các đầu kết thúc. Các liên kết này có tính kháng
nguyên cao nên cũng góp phần làm tăng tính kháng nguyên của phân tử protein [34,
37].
P.

pastoris có khả năng thực hiện nhiều biến đổi sau dịch mã đặc trƣng

củasinh vật nhân chuẩn nhƣ: xử lý các trình tự tín hiệu (gồm cả dạng pre và prepro),
gấp cuộn, tạo cầu nối disulfide, glycosyl hóa, phosphoryl hóa, acetyl hóa, sunfat
hóa, và gắn gốc đƣờng ở đầu O và N... góp phần làm tăng khả năng tan, ổn định về
tính chất của protein và tạo nên các phân tử protein có hoạt tính sinh học. Bên cạnh
5

protein của ngƣời.

6


1.1.3. Quá trình chuyển hóa methanol ở P. pastoris
P. pastoris có khả năng sử dụng methanol nhƣ nguồn cacbon và năng lƣợng
duy nhất. Quá trình chuyển hóa methanol xảy ra trong bào quan chuyên biệt là
peroxisome để tránh tác dụng gây độc của hydrogen peroxide. Các con đƣờng
chuyển hóa methanol trong nấm men liên quan tới một hệ enzyme, một trong số đó
là enzyme alcohol oxydase (AOX). Enzyme này xúc tác phản ứng oxy hóa
methanol thành formaldehyde. Đây là bƣớc đầu tiên của quá trình chuyển hóa
methanol (Hình1.2). Phản ứng này tạo ra sản phẩm phụ hydrogen peroxide là chất
gây độc cho tế bào. Vì lý do này nên phản ứng đầu tiên phải xảy ra trong
peroxisome do cơ quan nội bào này có thể thu hồi và phân giải H 2O2[9].
Formaldehyde đƣợc chuyển từ peroxisome ra ngoài tế bào chất và tham gia vào các
con đƣờng trao đổi chất khác. Có hai gen mã hóa cho alcohol oxydase là AOX1 và
AOX2. GeneAOX1 chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính AOX1 của tế bào. Quá
trình biểu hiện geneAOX1 đƣợc điều hòa chặt chẽ bởi cơ chế ức chế/kìm hãm và cơ
chế cảm ứng. Tuy nhiên, sự có mặt của methanol là cần thiết để kích hoạt phiên mã
geneAOX1 lên mức độ cao hơn. Do alcohol oxidase là enzyme có hoạt tính thấp với
oxy phân tử, nên tế bào nấm men tổng hợp một lƣợng lớn enzyme này để bù lại [10,
12]. Đây là một trong những nhân tố cơ bản trong quá trình phát triển hệ biểu hiện
P.
pastoris, promoter điều khiển tổng hợp AOX cũng đƣợc thiết kế cho quá
trình
tổng hợp protein ngoại lai.

7


tín hiệu lƣới nội chất thô(2). Sau khi dịch mã đƣợc hoàn tất trong lƣới nội chất, các
protein này di chuyển đến phức hệ Golgi nhờ các túi tiết (3), từ đây các protein
đƣợc phân khu đến các đích khác nhau 4a, 4b, 4c. Trƣờng hợp các protein không
chứa trình tự tín hiệu lƣới nội chất, các protein này đƣợc tổng hợp hoàn toàn trên
các ribosome tự do và đƣợc giải phóng vào trong tế bào chất (2’). Các protein chứa

9


các trình tự tín hiệu đích khác nhau sẽ hấp thụ bởi các bào quan chuyên biệt tƣơng
ứng: ti thể 3a, 4a, lục lạp 3b, peroxisome 3c, 4b hoặc nhân 3d, 4c.
1.1.5. Vector biểu hiệngene ngoại lai củaP. pastoris
1.1.5.1. Đặc điểm chung của vector biểu hiện củaP. pastoris
Có nhiều vector biểu hiện dành cho P. pastoris đã đƣợc thiết kết và đều có 5
yếu tố sau [19]:
1.

Promoter mạnh: thƣờng là promoter AOX1 (5’ AOX1) là một đoạn trình tự

có chiều dài gần 1kb, cho phép protein đƣợc biểu hiện mạnh trong Pichia và định
hƣớng plasmid tích hợp vào hệ gene nấm men tại locus AOX1. Ngoài ra còn có
trình tự nằm sau trình tự kết thúc phiên mã ở đầu 3’ của gene AOX1 có tác dụng
định hƣớng plasmid tích hợp với hệ gene nấm men tại vị trí locus AOX1 [24].
2. Có một hoặc nhiều vị trí đa cắt nối (MCS): cho phép chèn gene mong muốn
vào vector biểu hiện.
3. Trình tự kết thúc dịch mã có nguồn gốc từ geneAOX1 của P. pastoris là trình
tự dài khoảng 260 bp, cho phép kết thúc quá trình dịch mã và sự thêm đuôi poly A ở
mRNA có hiệu quả cao.
4.
Gene chỉ thị chọn lọc (His4): là một gen nguyên vẹn của Pichiamã

đồng trong bộ gene nấm men. DNA tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản
sao trong bộ gene tế bào chủ.
11


Ở
chéo

+

s

chủng Mut hoặc (Mut ), gene sát nhập tại locus his4 do sự trao đổi

giữa locus his4 của nhiễm sắc thể nấm men và vector biểu hiện (Hình 1.5). Kết quả
+

có thể cho một hoặc nhiều bản sao của vector tại vị trí his4 và có kiểu hình His .
+

Làm thẳng vector bằng enzyme cắt giới hạn tại vị trí his4, kiểu hình Mut hay MutS
tùy thuộc vào chủng chủ sử dụng. Các dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao của
+

vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His biến nạp.

Hình 1.5 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí his4 [25]
1.2. Tổng quan về α-factor và geneMF(ALPHA)1
Sự sinh sản ở nấm men S. cerevisiae liên quan đến sự tiết và đáp ứng của các
peptide pheromone [26]. Các tế bào alpha tiết các nhân tố alpha (α-factor) để đáp

pheromone và các vai trò khác chƣa sáng tỏ. Một thể đột biến đặc biệt của mf1
(MF1::URA3A) có kiểu hình khác biệt, có khả năng kết hợp ở cƣờng độ thấp hơn
10 lần so với thể đột biến vô hiệu (bất hoạt) MF1 mất toàn bộ geneMF1[20, 22].

Thể đột biến MF1::UR3A mã hóa cho protein lai bao gồm trình tự tín hiệu của
geneMF1, vùng điều kiển và trình tự vùng đệm, theo sau bởi rất nhiều amino acid
đƣợc mã hóa bởi đoạn URA3 [22, 39]. Kiểu hình của thể đột biến MF1::URA3A
cho thấy sản phẩm này của gene lai ức chế quá trình sinh sản, MF1::URA3A là thể
đột biến thay đổi chức năng và do đó vùng điều thuộc geneMF1 của chủng nguyên

13


bản có lẽ đóng vai trò tăng cƣờng sự hợp nhất. Nhƣ vậy geneMF(ALPHA) đóng vai
trò kiểm soát và điều hòa quá trình sinh sản của nấm nem S. cerevisiae[8].
GeneMFALPHA gồn 2 gene là geneMF(ALPHA)1 và gene MF(ALPHA)2 mã
hóa pheromone lai alpha-factor ở tế bào alpha ở nấm men. Tuy nhiên, phần lớn
pheromone lai alpha đƣợc tạo ra bởi geneMF(ALPHA)1.
Trình tự cấu trúc geneMF(ALPHA)1:
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTC
CGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACA
AATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTTAGATTTAGAAGGGGATTTC
GATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTT
TATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCT
TTGGATAAAAGAGAGGCTGAAGCTTGGCATTGGTTGCAACTAAAACCTG
GCCAACCAATGTACAAGAGAGAAGCCGAAGCTGAAGCTTGGCATTGGC
TGCAACTAAAGCCTGGCCAACCAATGTACAAAAGAGAAGCCGACGCTG
AAGCTTGGCATTGGCTGCAACTAAAGCCTGGCCAACCAATGTACAAAAG
AGAAGCCGACGCTGAAGCTTGGCATTGGTTGCAGTTAAAACCCGGCCAA
CCAATGTACTAA [44].


HIS4

Hình 1.6: Thiết kế tạo các chủng nấm men P. pastoris tái tổ hợp[42]


14


A- chủng control; B- các chủng tái tổ hợp sinh protein ngoại lai: chủng sinh
amylase hoặc và chủng sinh interleukin-2. 5’PAOX1: trình tự 5’ AOX1 promoter; Stín hiệu tiết α-factor.(MF(ALPHA1));3’TAOX1: 3’AOX1 terminator; 3’AOX1: trình
tự 3’ AOX1; Amp: gene kháng kháng sinh Ampiciline; GOI: gene ngoại lai tích hợp
vào genome của chủng P. pastoris SMD1168 genome (AMY/IL-2).
1.3. Tổng quan về các protein ngoại lai trong đề tài
1.3.1. Tổng quan về Interleukin-2
Interleukin-2 (IL-2) ở ngƣời đƣợc biết đến dấu tiên nhƣ yếu tố kích thích
tăng trƣởng tế bào T, nó là một lymphokine có khả năng quản lý đáp ứng miễn dịch
mạnh và đã đƣợc xác định nhƣ một chất dùng trong hỗ trợ điều trị ung thƣ. IL-2 là
một cytokine do tế bào lympho T của hệ thống miễn dịch tổng hợp nên. IL-2 đƣợc
Morgan D.A. và các cộng sự phát hiện năm 1975 có hoạt tính kích thích sự sinh
trƣởng của các tế bào lympho T có nguồn gốc từ tủy xƣơng. IL-2 cũng là một trong
những cytokine đầu tiên đƣợc xác định ở mức độ phân tử. Geneil-2 đƣợc Devos và
các cộng sự nhân dòng năm 1983. Sau đó cấu trúc tinh thể của nó đƣợc làm sáng tỏ
năm 1992 bởi Taniguchi và các cộng sự. Về bản chất, IL-2 là một glycoprotein
đƣợc tiết dƣới dạng monome với khối lƣợng phân tử xấp xỉ 15 kDa. IL-2 tồn tại
với cấu trúc không gian có 4 xoắn α tạo thành dạng khá điển hình của cytokine loại
1. IL-2, cũng đƣợc gọi là yếu tố tăng trƣởng tế bào T, lần đầu tiên đƣợc mô tả nhƣ
là một lymphokine có khả năng hoạt hóa in vitro các tế bào T. IL-2 cũng đã đƣợc
quan sát thấy nhiều khả năng điều chỉnh miễn dịch khác nhƣ tính chất gây độc của
tế bào T, các tế bào giết tự nhiên (NK), kích hoạt tế bào B, và hoạt hóa các tế bào