ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ
HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN
NẤM MEN PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

MỞ ĐẦU

Hà Nội, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE
CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS
Chuyên nghành: Di truyền học
Mã số:

60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2014

Học viên:
Đặng Thị Thanh Nhàn


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV ........................................................................3
1.1.1. Lịch sử hình thành AIDS ...........................................................................3
1.1.2. Thực trạng nhiễm HIV-1 ............................................................................4
1.1.3. Cấu trúc hình thể và hệ gen của HIV-1 .....................................................5
1.1.4. Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay .....................................................9
1.2. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1 ..............................................................12
1.2.1. Protease HIV-1 ..........................................................................................12
1.2.2. Chức năng của protease HIV – 1. ............................................................13
1.2.3. Sơ lƣợc về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới. ..............13
1.2.4. Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt Nam ....................................16
1.3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P. PASTORIS ...........................................................17
1.3.1. Đặc điểm của P. pastoris .........................................................................18
1.3.2. Ƣu nhƣợc điểm của hệ thống biểu hiện P. pastoris .................................19
1.3.3. Chủng nấm men P. pastoris biểu hiện protease HIV-1 ...........................20
1.3.4. Vector nhân dòng và biểu hiện ở P. pastoris ...........................................21
1.3.5. Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris ..............................22

3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên P. pastoris ........47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................53
1. KẾT LUẬN ...........................................................................................................53
2. KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................54


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Cấu trúc của một hạt virus HIV-1......................................................................6
Hình 2. Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1......................................................................7
Hình 3. Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1................... ..............................12
Hình 4. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9.... ...................................................................21
Hình 5. Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus HIS4 giữa bộ gen của tế bào với vector
biểu hiện....................................................................................................................22

Hình 6. Kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR.................38
Hình 7. Điện di sản phẩm tách chiết plasmid...........................................................39
Hình 8. Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzym
giới hạn NotI và EcoRI..............................................................................................40
Hình 9. Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E. coli DH5α............................42
Hình 10. So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý thuyết..43
Hình 11. Sự hình thành khuẩn lạc trên P. pastoris SMD1168................................45
Hình 12. Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm
men............................................................................................................................46
Hình 13. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng P. pastoris SMD1168 sau khi biểu
hiện ở môi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời gian…………………………49
Hình 14. Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protease HIV-1 trong chủng
tái tổ hợp SMD1168..................................................................................................50
Hình 15. Kết quả kiểm tra protein bằng thẩm tách miễn dịch Western Blot...........51



BMGY

Buffered Minimal Glycerol Yeast

Bp

Base pair

DNA

Axit deoxyribonucleic

ddNTP

dideoxyribonucleotide – triphosphate

E. coli

Escherichia coli

HIV

Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời
(Human immunodeficiency virus)

HIS:

Histidine


Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PI

Chất ức chế protease (Protease Inlibitor)

RNA

Axit ribonucleic

SDS

Sodium dodecyl sunfat

SDS-PAGE:

phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamid có SDS
(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

UNAIDS

Chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc
( United Nation Program on HIV/AIDS)


MỞ ĐẦU
Virus gây suy giảm miễm dịch ở ngƣời (Human Immuno Deficiency VirusHIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở
ngƣời (AIDS). Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều ngƣời chết nhất trong lịch
sử loài ngƣời [49]. Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV
type 2 (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca

sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn.
Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia
coli (E. coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41]. Tuy
nhiên, E. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn nhƣ
mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng
cải biến protein sau tổng hợp). Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện
ở E. coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến
sau dịch mã không diễn ra. Hạn chế này đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng các hệ
thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men và động vật có vú. Nấm men
có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là
một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn. Nhiều protein của tế bào
nhân thực đã đƣợc sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) [10]. Ngoài S. cerevisiae, nấm men Pichia
pastoris (P. pastoris) cũng bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của
sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập và tạo
dòng. P. pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E. coli
hay S. cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27].
Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên
của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS,
cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P. pastoris so với E. coli,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa
protease của HIV-1 trên nấm men P. pastoris” với các nội dung:
- Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện.
- Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P.
pastoris.

2


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

lây nhiễm các phân nhóm khác nhau nhƣ phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và
Austalia, còn ở các nƣớc đang phát triển nhƣ Châu Á và Châu Phi, nơi mà có nhiều
ngƣời bị nhiễm HIV-1 đang sinh sống thì lại phổ biến các phân nhóm không thuộc
nhóm B. Cụ thể, theo ghi nhận của Ngân hàng Gen HIV Hoa Kỳ, kiểu gen
CRF25_CPX thƣờng chỉ xuất hiện ở Châu Phi [53]. Những nghiên cứu ban đầu về
dịch tễ học phân tử của HIV đã xác định đƣợc phân týp chính lƣu hành tại Việt
Nam đó là phân týp CRF01_AE (96,7%) và phân týp B (3,3%) [10]. Năm 2013,
Phạm Đức Minh và cộng sự đã công bố kết quả phân typ AE và B ở Việt Nam lần
lƣợt là 98,53% và 1,33%. [6]
1.1.2. Thực trạng nhiễm HIV-1
Sau gần nửa thế kỷ phát hiện ra HIV đến nay, HIV/AIDS vẫn là đại dịch thế
kỷ chƣa có vaccine phòng ngừa hay thuốc chữa trị đặc hiệu. Với tốc độ lây lan
nhanh, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt là ở khu vực Châu Phi và
các nƣớc Châu Á. Theo ƣớc tính của chƣơng trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc
UNAIDS, trung bình mỗi ngày trên thế giới có thêm khoảng 7000 ngƣời nhiễm
HIV. UNAIDS đã công bố báo cáo thống kê trong năm 2012 thế giới có khoảng 2,3
triệu các trƣờng hợp nhiễm mới HIV ở ngƣời lớn và trẻ em, giảm 33% so với năm
2001, các trƣờng hợp tử vong liên quan đến AIDS cũng giảm 30% so với mức đỉnh
năm 2005 [49]. Đây là kết quả của sự nỗ lực không ngừng trong công tác truyền
thông phòng, chống HIV và việc mở rộng tiếp cận điều trị theo hƣớng kháng virus
làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sự sống cho ngƣời bệnh. Những con số thống
kê này cho thấy hy vọng có thể ngăn chặn và đẩy lùi đại dịch HIV/AIDS trên toàn
cầu khi nâng cao hơn nữa tính hiệu quả của các phƣơng pháp điều trị phòng và
chống HIV/AIDS.
Tuy nhiên, theo công bố của WHO, HIV vẫn tiếp tục là một vấn đề y tế công
cộng quan trọng toàn cầu. Đến hết năm 2013 trên toàn thế giới, có khoảng 1,5 triệu
ngƣời chết vì các nguyên nhân liên quan đến HIV, 33,2 - 37,2 triệu ngƣời sống
chung với HIV với hơn 2,1 triệu ngƣời nhiễm mới. Trong đó, Sahara Châu Phi là
khu vực có số ngƣời nhiễm HIV lớn nhất thế giới với trên 24,7 triệu ngƣời sống


Hình 1. Cấu trúc của một hạt virus HIV-1 [28]

Về cấu tạo (Hình 1), HIV-1 có dạng hình cầu, có đƣờng kính 100 nm và
đƣợc bao quanh bởi màng lipoprotein. Lớp ngoài cùng của virus là lớp lipit kép với
nhiều protein Env gắn vào và nhô lên. Protein Env gồm hai phần là phần chỏm
(gp120) và phần thân (gp41). Trong quá trình nảy chồi, các protein khác nhau từ
màng của tế bào vật chủ có thể đƣợc gắn vào màng lipoprotein của virus, (chẳng
hạn nhƣ protein HLA lớp I và II, hay protein bám dính ICAM) tạo điều kiện cho
virus tiếp xúc, gắn vào các tế bào mục tiêu. Bên trong màng lipoprotein là protein
P17, tiếp đến là lõi của virus. Lõi có dạng hình trụ đƣợc bao bọc bởi lớp capsid
đƣợc tạo thành từ 2000 bản sao của protein p24. Bên trong lõi có hai bản sao của
RNA HIV-1, các enzym phiên mã ngƣợc và integrase [28].
1.1.3.2. Cấu tạo hệ gen của HIV
Virus HIV-1 có hệ gen nằm trong phần lõi với hai sợi RNA (+) đơn, trên mỗi
sợi có 9 gen mã hoá cho 15 protein khác nhau và có chiều dài khoảng 9,8 kb. Mỗi
sợi RNA (Hình 2), có 3 gen cấu trúc là gen gag “group- antigen (kháng nguyên
nhóm)”; gen pol “polymerase” và gen env “envelope - vỏ”. Các gen gag và env mã
hoá cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hoá cho 3 enzym

6


reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Ngoài 3 gen chính, HIV1 còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa cho các
protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm
các loại bệnh khác nhau [28].

Hình 2. Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1 [28]
Bao gồm 9 gen: gag, pol, vif, vpr, vpu, env, tat, rev và gen nef.
Gal, pol, env là 3 gen cấu trúc mã hóa các protein cấu tạo vỏ và lõi virus HIV-1
Tat, rev, vif, vpr, vpu và nef là 6 gen phụ

chuyển thành 2 sợi DNA xoắn mạch thẳng, sau đó chuyển thành DNA xoắn dạng
vòng chui qua màng nhân vào trong nhân tế bào. Nhờ enzym integrase mà sợi DNA
virus đƣợc chèn vào DNA nhiễm sắc thể của tế bào chủ. DNA virus đƣợc hợp thành
có thể tồn tại ở trạng thái tiềm tàng trong nhiều giờ hoặc nhiều năm trƣớc khi trở
thành dạng hoạt động mà không có biểu hiện bệnh [26]. Sau khi lây nhiễm vào vật
chủ, hệ gen của virus HIV-1 sẽ đƣợc sao chép nhờ sự điều khiển phức tạp của một
số protein nhƣ Tat và các yếu tố sao chép DNA của tế bào vật chủ. Do hệ gen vật
chủ bị thay đổi cấu trúc khi DNA của virus chèn vào, DNA của virus chỉ thị cho tế
bào phiên mã ra RNA virus nhờ enzym DNA polymerase tế bào vật chủ. Số lƣợng
RNA của virus đƣợc tăng lên, tiếp tục tổng hợp các protein virus nhờ ribosome của
tế bào vật chủ, chúng cùng di chuyển ra tế bào chất hoặc màng tế bào, sau đó là quá
trình nảy chồi tạo thành các viron nằm trên màng hoặc tách ra khỏi tế bào chủ, đi
vào máu và tiếp tục gắn vào các tế bào lympho T khác [26; 28].

8


1.1.4. Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay
Lý do khiến cho việc phát triển vaccine phòng chống nhiễm HIV-1 gặp rất
nhiều khó khăn và thƣờng thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, lại thƣờng
xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên. Sau nhiều nghiên cứu, đến
ngày 6 tháng 3 năm 2012, các nhà nghiên cứu sinh học hàng đầu Cuba đã thử
nghiệm thành công một loại vaccine mới với tên Teravac chống HIV/AIDS trên
chuột, đã sẵn sàng để thử nghiệm trên con ngƣời. Vaccine đƣợc triển khai từ một
protein tái tổ hợp có những phân tử giống virus, kích thích đáp ứng miễn dịch. Tuy
nhiên, theo Iglesias, trƣởng nhóm nghiên cứu vaccine Teravac, vaccine này ban đầu
phải đƣợc thử nghiệm lâm sàng với số lƣợng nhỏ, trên một nhóm bệnh nhân AIDS
đang ở giai đoạn đầu và cũng không nên hy vọng quá cao vào vaccine này. Tiếp
theo là các cuộc thử nghiệm nhằm kiểm tra độ an toàn của vaccine, và việc phát
triển một vaccine hiệu quả đòi hỏi nhiều năm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

uống nhiều lần thuốc trong một ngày và việc điều trị kéo dài gây ra một số tác dụng
phụ nhƣ: bệnh dạ dày, ruột, giảm chức năng gan, rối loạn lipid máu, loạn nhịp tim
[13]. Những hạn chế này cũng đã đƣợc khắc phục khi PI mới (PI tăng cƣờng) ra
đời. Thuốc PI tăng cƣờng đƣợc phân biệt với thuốc PI bằng chữ “r” thêm vào sau
tên thuốc. Các thuốc trong nhóm gồm saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir,
amprenavir, lopinavir và atazanavir.
+ Các chất ức chế reverse transcriptase không nucleoside (NNRTI). Những thuốc
này phong bế hoàn toàn vị trí gắn các chất hoạt hóa enzym reverse transcriptase
bằng cách gắn trực tiếp với enzym này, làm giảm quá trình tổng hợp axit nucleic.
Nhóm thuốc này gồm các thuốc nevirapine, delavirdine và efavirenz. Một số nghiên
cứu cho rằng nếu đảm bảo đã ức chế đƣợc virus thì có thể dùng NNRTI điều trị thay
cho PI. Trong trƣờng hợp này, sử dụng NNRTI đôi khi đem lại hiệu lực tốt hơn việc
tiếp tục điều trị bằng các thuốc PI [28].
+ Các chất ức chế enzym reverse transcriptase nucleoside (NtRTI): Hoạt động của
nhóm thuốc này rất giống với NRTI nhƣng tác dụng nhanh hơn. Tenofovir là thuốc
duy nhất trong nhóm này có thể ức chế cả HIV và viêm gan B, đặc biệt lại có có
hiệu quả ngay cả ở bệnh nhân đã kháng NRTI.

10


+ Các chất ức chế hoà nhập: Nhóm thuốc này không cho virus nhân lên bằng cách
ngăn không cho màng virus hoà nhập với màng của tế bào khỏe mạnh. Thuốc đầu
tiên trong nhóm này là enfuvirtide.
Để tăng hiệu quả và hạn chế tác dụng phụ, các loại thuốc thƣờng đƣợc dùng
phối hợp trong điểu trị cho các bệnh nhân HIV/AIDS. Thực tế cho thấy, HIV/AIDS
rất khó điều trị triệt để. Thời gian ƣớc lƣợng có thể xoá sạch các tế bào mang HIV-1
là 73,3 năm, nghĩa là HIV-1 không thể chữa khỏi hoàn toàn [44].
Đối mặt với nhiều khó khăn, cùng với sự biến đổi phức tạp của HIV-1, các
nhà khoa học vẫn đang nỗ lực không ngừng, nghiên cứu và tìm ra thuốc chống HIV



1.2.2. Chức năng của protease HIV – 1
Về mặt sinh học, protease HIV-1 có vai trò quan trọng trong chu trình nhân
lên của HIV-1. Các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) là cơ chất đặc hiệu của
protease HIV-1, các polyprotein này đƣợc protease HIV-1 cắt thành các protein cấu
trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Cụ thể, protease HIV-1 có thể
nhận biết và cắt các liên kết khác nhau trên chuỗi polypeptide gag để tạo thành các
protein cấu trúc: matrix P17 (MA), capsid p24 (CA), nucleocapsid p7 (NC) có vai
trò quan trọng hình thành lớp capsid và các protein bao bọc lõi tạo virus hoàn chỉnh;
protease HIV-1 còn thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành ba enzym: protease,
reverse transcriptase và integrase cần thiết cho sự sao chép của HIV trong quá trình
lây nhiễm [25].
Ngoài ảnh hƣởng đến quá trình lây nhiễm, protease HIV-1 còn đóng vai trò
quan trọng trong quá trình sinh bệnh. Khi đã xâm nhiễm vào tế bào ngƣời, protease
HIV-1 không chỉ phân cắt các polypeptide của chính nó mà còn có thể thủy phân rất
nhiều protein của vật chủ nhƣ actin, procaspase 8, Bcl2 (protein điều hòa chết theo
chƣơng trình - apoptosis) [43]. Khi protease HIV-1 xuất hiện, gây độc và làm rối
loạn các hoạt động trong tế bào vật chủ. Nhiều nghiên cứu cũng khẳng định, sử
dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tƣợng chết theo chƣơng trình
do protease HIV-1 gây nên [43].
Nhƣ vậy, Protease HIV-1 có vai trò quan trọng không thể thiếu trong chu
trình nhân lên của virus cũng nhƣ quá trình sinh bệnh ở ngƣời. Khi protease HIV-1
bị ức chế hoặc gen mã hóa protease HIV-1 bị đột biến, virus không thể đóng gói
thành virion hoàn chỉnh nên không thể xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19]. Một
trong những chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 đƣợc biết đến đầu tiên là
pepstatin A [45].
1.2.3. Sơ lƣợc về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới
Nguyên nhân mà cho đến nay chƣa sản xuất đƣợc vaccine HIV là do sự biến
đổi liên tục của kháng nguyên HIV-1, vì thế mà những bệnh nhân nhiễm HIV-1 chỉ

trình biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn E. coli. Nghiên cứu chỉ ra rằng, protease
HIV-1 tái tổ hợp không thể biểu hiện một cách đơn giản nhƣ các protein tái tổ hợp
khác ở vi khuẩn E. coli [41].

14


Năm 1993, Leuthardt và Roesel nghiên cứu gắn thêm 3 gốc histidine
(3xHIS) ở đầu N và đầu C của protease trong nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch
protease HIV-1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H trên E. coli. Việc gắn
thêm 6 gốc HIS là một cải tiến tạo thuận lợi cho quá trình tinh sạch [31]. Kết quả
của nghiên cứu cho thấy 90% protease HIV-1 sau biểu hiện đƣợc thu ở phân đoạn
tủa của tế bào (pellet) và đƣợc hòa tan hiệu quả bằng đệm ly giải có guanidine 6M.
Protease HIV-1 đã đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu biểu hiện trên vi khuẩn E.
coli bằng cách thiết kế các vector khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên cứu này cũng
cho thấy biểu hiện protease HIV-1 có hoạt tính là gây độc giết chết tế bào [18]. Các
nhà nghiên cứu đƣa ra nhiều lý do giải thích, trong đó có dự đoán rằng protease
HIV-1 có thể thủy phân các protein chức năng của tế bào vi khuẩn E. coli [18].
Nhằm tìm cách khắc phục tính độc này, một số nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và
biểu hiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống và quy trình biểu hiện
khác nhau nhƣ sử dụng các promoter trp, λPL, ara BAD và tac [19; 46]. Một số
nghiên cứu đã tiến hành biểu hiện protease HIV-1 ở nấm men S. cerevisiae [39].
Pichuantes và tập thể (1989) đã biểu hiện thành công protease HIV-1 tái tổ hợp ở
nấm men [39]. Protease tạo ra cũng có hoạt tính tự cắt khỏi dạng protein dung hợp
để giải phóng protease HIV-1 99 axit amin cũng nhƣ có hoạt tính cắt cơ chất protein
gag tự nhiên.
Theo kết quả công bố của nhiều nhóm nghiên cứu về biểu hiện protease
HIV-1 cho thấy rằng quá trình sản xuất protease này vẫn còn gặp nhiều khó khăn:
Thứ nhất do protease HIV-1 có hoạt tính gây độc với tế bào chủ và chủ yếu đƣợc
biểu hiện ở dạng không hòa tan (90% dạng thể vùi) [15; 31]; Thứ hai do hàm lƣợng

đƣợc gen mã hóa tiểu đơn vị P66 của reverse transcriptase của HIV-1 ở E. coli để
dùng cho các phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA và tạo bộ kit chẩn đoán nhiễm
retrovirus [1]; Đồng Văn Quyền và tập thể (2008), Bạch Thị Nhƣ Quỳnh và tập thể
(2011) cũng đã biểu hiện thành công 3 gen mã hóa cho các kháng nguyên GP41,
GP120 và P24 của HIV ở E. coli [7; 8].
Từ năm 2003, Việt Nam đã sử dụng thuốc ức chế protease (PI) nhập nội để
điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS [49]. Việc tự sản xuất protease HIV-1 vẫn còn
trong thời gian nghiên cứu và thử nghiệm. Các nghiên cứu chủ yếu nhằm phát hiện

16


HIV trong huyết thanh, xác định các nhóm virus HIV gây bệnh và các đột biến liên
quan đến tính kháng thuốc, hoặc phát triển kit chẩn đoán HIV ở Việt Nam [3; 6; 9].
Nhằm thiết kế thuốc PI mới phù hợp với các chủng HIV lƣu hành tại Việt Nam,
năm 2010, các nhà khoa học của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym
và Protein, Khoa Sinh học, trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội,
do Giáo sƣ Phan Tuấn Nghĩa chỉ đạo, đã bắt tay vào nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu
protease virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV) phân lập tại Việt Nam”, nhằm
mở ra khả năng tự sản xuất PI chống HIV ở Việt Nam. Đây là công trình đầu tiên ở
Việt Nam nghiên cứu có tính hệ thống, bài bản về phân lập, nhân dòng và biểu hiện
gen mã hóa protease HIV-1 tái tổ hợp từ chủng CRF01-AE của Việt Nam trong E.
coli [54]. Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc thu nhận từ bệnh
nhân nhiễm HIV tại Việt Nam, tác giả đã biểu hiện thành công gen mã hóa protease
HIV-1 trong E. coli bằng vector pET32a, xây dựng đƣợc quy trình tinh sạch
protease HIV-1 tái tổ hợp chỉ với hai bƣớc và nghiên cứu một số tính chất của
protease HIV-1 [3]. Trong nghiên cứu này, tác giả cũng đã cải tiến gắn vào đầu N
trình tự tự cắt là 7 axit amin của protein gag-pol và đuôi 6xHIS tại đầu C của
protease HIV-1. Với cải tiến này, protease HIV-1 sau tổng hợp sẽ là chuỗi
polypeptide bắt đầu bằng axit amin Pro, và đuôi 6x HIS tạo thuận lợi cho quá trình