ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRỊNH TẤT CƢỜNG



1.2.

Cấu trúc và hình dạng của GABA.................................................................. 3

1.3.

Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não.................................. 4

1.4.

Enzym tổng hợp GABA.................................................................................. 5

1.5.

Thụ thể GABA................................................................................................ 6

1.6.

Sản xuất GABA từ vi sinh vật......................................................................... 7

1.7.

Cơ chất tham gia sản xuất GABA................................................................... 9

1.8.

Thực phẩm chức năng GABA...................................................................... 10

1.8.1. Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA......10

2.2.1.7. Chiết xuất glutamic acid trong cám gạo bằng phƣơng pháp nƣớc sôi 20
2.2.1.8. Xác định GABA bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC) [41]. . .20
2.2.1.9. Định lƣợng GABA bằng phƣơng pháp so màu [57].........................21
2.2.1.10. Xác định nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men.........................22
2.2.1.11. Tìm các điều kiện lên men thích hợp trên môi trƣờng dịch cám gạo . 23

2.2.2. Tinh chế GABA [31]................................................................................. 24
2.2.2.1. Khử màu............................................................................................ 24
2.2.2.2. Khử muối........................................................................................... 24
2.2.2.3. Chạy sắc ký trao đổi ion.................................................................... 24
2.2.2.4. Kết tinh GABA.................................................................................. 25
2.2.3. Đánh giá hoạt tính GABA........................................................................ 25
2.2.3.1. Nuôi tế bào WSS-1 và tế bào PC12................................................... 25
2.2.3.2. Đánh giá khả năng sống chết của tế bào............................................ 26
2.2.3.3. Xác định GABA bằng phƣơng pháp HPLC [42]............................... 26
2.2.3.4. Đánh giá hoạt tính GABA dựa vào sự thay đổi màu iot [49].............26
2.2.3.5. Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot...............................27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 29
3.1.

Quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo..................................... 29

3.1.1. Khả năng sinh GABA của chủng KC1...................................................... 29
3.1.2. Các chỉ tiêu chất lƣợng và an toàn thực phẩm của cám gạo.....................29
3.1.3. Đánh giá hoạt động của GAD trong cám gạo........................................... 30
3.1.4. Xác định thành phần và lựa chọn nguyên liệu cám gạo............................31
3.1.4.1. Xác định định tính glutamic acid trong hai mẫu cám gạo..................31
3.1.4.2. Định lƣợng glutamic acid trong hai mẫu cám gạo............................. 32
3.1.5. Lƣợng glutamic acid thu đƣợc bằng phƣơng pháp nƣớc sôi...................34
3.1.6. Đƣờng chuẩn GABA xác định hàm lƣợng GABA bằng phƣơng pháp so


GA

GAB

GA

H

K

m

m

M

M

O

PL

TC

TL

TP

v



Hình 20: Khả năng bảo vệ tế bào PC12 của dịch lên men chủng Lactobacillusplantarum KLEPT............................................................................................................................. 48
Hình 21: Sắc ký đồ của GABA chuẩn....................................................................................... 49
Hình 22: Xây dựng đƣờng chuẩn GABA qua HPLC......................................................... 49
Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men.................................................................... 50
Hình 24: Chạy các phân đoạn tách chiết bằng sắc ký cột................................................... 51
Hình 25: Đƣa mẫu GABA tinh sạch vào đƣờng chuẩn để xác định độ tinh sạch của
mẫu.......................................................................................................................................................... 52
Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dƣới kính soi nổi sau 24 giờ nuôi cấy tế bào WSS-1
(A), sau 48 giờ (B)............................................................................................................................ 53
Hình 27: Kết quả thay đổi OD của Iot dựa vào thay đổi nồng độ của GABA lên
men.......................................................................................................................................................... 54
Hình 28: Đƣờng chuẩn giữa nồng độ GABA và mật độ quang tại bƣớc sóng
405nm..................................................................................................................................................... 55

vii


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Thành phần môi trƣờng MRS...................................................................................... 15
Bảng 2: Chỉ tiêu chất lƣợng của hai mẫu cám gạo............................................................... 30
Bảng 4: Giá trị glutamic acid của các mẫu cám gạo............................................................ 33
Bảng 5: Lƣợng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon...................... 38
Bảng 6: Lƣợng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ...........................39
Bảng 7: Tỉ lệ MSG (%) ảnh hƣởng tới hiệu suất tạo GABA trong hai loại môi
trƣờng.................................................................................................................................................... 40
Bảng 8: Hàm lƣợng GABA trong dịch lên men theo hai phƣơng pháp đo.................55

viii

đƣợc sự thay đổi kênh ion clorua để kiểm tra hoạt tính của tế bào.

1


Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo
bằng Lactobacillus”
Nghiên cứu thực hiện nhằm các mục tiêu:
+ Xây dựng quy trình lên men phù hợp để sản xuất GABA từ dịch cám gạo bằng

chủng Lactobacillus plantarum KLEPT đạt hiệu suất cao 10 lít/ mẻ.
+ Đánh giá hoạt tính GABA thông qua thụ thể GABA.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Gama-Aminobutyric axit (GABA)
GABA là một axít amin có trong tự nhiên, ở thực vật bậc cao nhƣ khoai tây,
đậu tƣơng, lúa, gạo lứt còn nguyên phôi.
Trong cơ thể, GABA đƣợc phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ƣơng vào
khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhƣng đến năm 1960, GABA mới đƣợc đề
xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể. Ngoài não, GABA cũng có
mặt trong tế bào B tuyến tụy, buồng trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa. GABA có chức
năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [5]. Hoạt động của GABA cùng với
glutamate và aspartate thực hiện phần lớn hoạt động thông qua khe xináp trong hệ
thống thần kinh trung ƣơng [20, 51].
Một số vai trò của GABA với sức khỏe của con ngƣời:
- Giảm bớt trạng thái căng thẳng và bất an, giúp ngủ ngon và ngủ sâu hơn.

tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau bao gồm dạng gấp khúc, dạng mạch thẳng.
Chính nhờ khả năng tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau này tạo cho GABA có
nhiều chức năng sinh học quan trọng [20, 22].

Hình 1: Cấu trúc của GABA [58]
1.3. Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não
GABA tham gia vào nhiều quá trình của hệ thống thần kinh trung ƣơng. Chẳng
hạn nhƣ liên quan đến tâm trạng lo âu, trầm cảm… Bởi vì, GABA không thể xuyên
qua đƣợc hàng rào để vào trong não. Do vậy, GABA đƣợc tổng hợp trong não bằng
con đƣờng trao đổi chất đƣợc biết là “GABA shunt” (hình 2). Giai đoạn cuối của
con đƣờng này sinh ra GABA thông qua quá trình chuyển hóa L-glutamate bằng sự
phân cắt của enzym glutamic acid decarboxylase (GAD) nhờ kích thích truyền tín
hiệu thần kinh [20, 22].
Khi lƣợng GABA đƣợc sinh ra vƣợt quá ngƣỡng từ tín hiệu tế bào thần kinh
sẽ đƣợc một enzym gọi là gamma-aminobutyric acid transaminase (GABA-T) làm
giảm bớt [20]. Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tổng hợp GABA từ semialdehyde
succinic nhƣng vai trò cơ bản của enzyme này là phá hủy GABA. Ngoài ra, những
chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra một lƣợng lớn GABA ở trong
não [20]. Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có sự tham gia của vitamin

4


B6 hay còn đƣợc gọi là pyridoxal-5’-phophate đƣợc xem nhƣ một cofactor [32].
Cofactor này mang semialdehyde succinic tạo thành GABA ở trong não.

Hình 2: Con đƣờng tổng hợp và phân hủy của GABA (GABA shunt) [40]
GABA đảm bảo duy trì hoạt động bình thƣờng của não bộ đặc biệt là các
neuron thần kinh. GABA đóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt động của
các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền tín hiệu.


sắp xếp tạo ra một lõi cho phép kênh Cl đi qua (Hình 3). GABAA có vai trò cơ bản
trong điều khiển các biểu hiện lo âu và ảnh hƣởng tới trí nhớ ở não. Các tế bào thần
kinh sản xuất ra GABA đƣợc gọi là các thần kinh GABAergic và hoạt động chính
trong quá trình ức chế ở các động vật có xƣơng sống trong giai đoạn trƣởng thành
[39]. 17-20% neuron thần kinh là GABAergic và hầu hết các hoạt tính sinh lý của

GABA đƣợc tạo thành thông qua thụ thể GABA A. Trong động vật có xƣơng sống,
GABA hoạt động ở các khe xináp trong não bằng liên kết với thụ thể GABA xuyên
màng tế bào thần kinh. Quá trình liên kết này sẽ dẫn tới mở kênh ion để cho phép
-

kênh ion mang điện tích âm Cl đi vào trong tế bào hoặc kênh ion mang điện tích
dƣơng ra ngoài tế bào. Quá trình này sẽ tạo ra điện thế âm ở trên màng tế bào dẫn
tới vị trí này thƣờng xuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh [20].

Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA [59]

6


Thụ thể GABAB có hai tiểu đơn vị là GABA B1 và GABAB2 (Hình 4).
GABAB1 có vai trò nhận dạng phối tử bên ngoài tế bào còn GABA B2 có nhiệm vụ ở
trên màng tế bào và truyền tín hiệu. Thụ thể GABA B đƣợc ứng dụng nhƣ là đích để
tìm các loại thuốc trong điều trị dƣợc học và liên quan đến vai trò truyền tín hiệu về
khứu giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển, tăng hocmon và tín hiệu trầm cảm [20].

Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB [59]

Hình 5: Hoạt động của thụ thể trƣớc và sau khi gắn kết với GABA

Ngoài ra, một số vi sinh vật khác cũng có khả năng sinh GABA đã đƣợc ứng
dụng chẳng hạn nhƣ vi khuẩn kỵ khí đã sản xuất GABA trong các loại chè nhƣ chè
mầm tƣơi, chè đen, chè Gabaron, chè olong, chè xanh [5].
Lactobacillus (viết tắt là Lb) là một chi trong nhóm vi khuẩn lactic, là những
trực khuẩn không sinh bào tử thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng. Trình tự gen GAD
đƣợc tìm thấy trong Lactobacillus brevis [38], Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus [48], Lactobacillus paracasei [25], và
Lactococcus lactis subsp. Lactis [34].

8


Trong các thập kỉ qua, các nghiên cứu cơ bản mở ra một lĩnh vực nghiên cứu
mới đối với các chất có hoạt tính sinh học hoặc các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc
từ thực phẩm.Việc sử dụng các chủng trên trong lên men tổng hợp GABA đã đƣợc
nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng trong thực tế. Hiện nay, việc lên men
Lactobacillus plantarum để tổng hợp GABA từ các nguồn nguyên liệu dƣ thừa của
nông nghiệp đang là một hƣớng mới đầy tiềm năng. Hoạt động của GAD trong
Lactobacillus plantarum giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại pH thấp của môi trƣờng.
Sau khi hấp thụ L-glutamate từ các transpoter đặc hiệu, GAD sẽ xúc tác phản ứng
decarboxyl hóa L-glutamate trong tế bào chất, dẫn đến tiêu thụ một proton trong tế
bào, kết quả làm tăng độ pH của tế bào chất và tăng pH ngoại bào do chuyển đổi Lglutamate thành GABA kiềm hơn [25, 14].
1.7. Cơ chất tham gia sản xuất GABA
Monosodium glutamate (MSG) đƣợc xem nhƣ là một cơ chất trong quá trình sản
xuất Axit gamma-aminobutyric (GABA) bằng vi khuẩn lactic [28]. MSG là một dạng
muối của glutamic axit. MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino axit mà đƣợc tìm thấy
trong đa số các thực phẩm. Đặc biệt các thực phẩm chứa hàm lƣợng protein cao chẳng
hạn nhƣ bơ, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau. Trong thực phẩm thƣờng sử dụng
MSG để tạo ra vị đã đƣợc biết tới khoảng 1200 năm về trƣớc. Với vị đặc biệt của
MSG đã có tên là “ Unami” trong ngƣời dân Nhật Bản. Nó đã có mặt trên thị trƣờng

phẩm cho con ngƣời vì không cho vị giác ngon nên không thể ăn hàng ngày với
một lƣợng lớn cho mục đích tăng cƣờng hệ miễn dịch. Chính vì vậy, đã có một số
công trình nghiên cứu cám gạo nhƣ là một nguồn sản xuất GABA. Tuy nhiên, với
những điều kiện tối ƣu để làm tăng cƣờng quá trình hoạt động của GAD trong cám
gạo thì cũng chỉ cho hàm lƣợng GABA là 29 g/100 g cám gạo [36]. Ngoài ra, một
công bố gần đây của nhóm nghiên cứu Hàn Quốc đã sử dụng Lactobacillus để lên
men dịch cám gạo đã cho hiệu suất lên men GABA là 660 mM trong dịch lên men
từ 1 kg cám gạo đã đƣợc bổ sung thêm 10 lít nƣớc và 12% MSG tƣơng đƣơng với
679 g/1kg cám gạo [28].
1.8.2. Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam
Tại Việt Nam, cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về GABA nhƣ
tách chiết GABA từ đậu tƣơng hoặc dự án cấp nhà nƣớc năm 2007 về nghiên cứu

10


công nghệ sản xuất một số thực phẩm chức năng giàu GABA phòng chống bệnh nhân
ung thƣ do Viện Công nghệ Thực phẩm chủ trì. Tuy nhiên, khả năng ứng dụng sản xuất
ở mức quy mô công nghiệp vẫn chƣa hiệu quả vì sử dụng nguồn nguyên liệu đắt tiền
do đó giá thành còn cao. Hơn nữa, sản phẩm tạo ra để ứng dụng vào thực phẩm chức
năng đang còn hạn chế về phƣơng pháp kiểm tra hoạt tính sinh học. Trong khi đó, một
số công ty dƣợc của Trung Quốc đang bán GABA với giá chỉ khoảng 400.000 đồng/kg.
Tuy nhiên, cho tới nay vẫn chƣa có một công trình nghiên cứu nào sử dụng cám gạo
nhƣ một nguồn nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất GABA. Trong khi đó, nguồn
nguyên liệu lên men từ cám gạo trong nƣớc rất dồi dào, giá thành thấp và gần nhƣ chỉ
sử dụng để làm thức ăn gia súc. Do vậy, đây là một trong những lý do chính giúp cho
quá trình sản xuất GABA có giá thành thấp.

1.9. Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể
Trong cơ thể, tế bào có rất nhiều quá trình sinh hóa thiết yếu cho sự sống và hoạt

đổi ái lực tƣơng tác giữa các chất gắn với protein thụ thể, nhƣng cũng bộc lộ nhiều
hạn chế chẳng hạn nhƣ: nguy cơ phơi nhiễm phóng xạ và ảnh hƣởng đến sức khỏe,
cộng đồng và môi trƣờng xung quanh, cần chi phí cao cho thiết kế và xây dựng
phòng thí nghiệm đảm bảo an toàn phóng xạ, trang thiết bị phân tích phóng xạ và
nguyên vật liệu có giá thành cao. Hiện nay, một phƣơng pháp khác không sử dụng
đồng vị phóng xạ đó là dùng chất gắn đặc hiệu huỳnh quang bởi fluorescein trên mô
hình ở thụ thể đích. Phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng khá phổ biến trên thế giới
và có độ chính xác cao. Với phƣơng pháp này, thì hoàn toàn có thể tiếp cận đƣợc
một phƣơng pháp sàng lọc mới hiện đang sử dụng rất nhiều ở trên thế giới là High
throughput screening. Đây là một quá trình thí nghiệm khoa học đặc biệt đƣợc sử
dụng trong khám phá ra các loại thuốc và liên quan tới lĩnh vực sinh học và hóa học.
High throughput screening cho phép nhà nghiên cứu đánh giá nhanh hàng triệu điều
kiện về kiểm tra dƣợc học di truyền, hóa học. Thông qua quá trình này có thể nhận
dạng nhanh các hợp chất có hoạt tính, kháng thể và gen tham gia điều khiển con
đƣờng phân tử sinh học cụ thể. Những kết quả của phƣơng pháp này sẽ giúp cho
quá trình khởi đầu tạo ra những loại thuốc mới và hiểu quá trình tƣơng tác hoặc vai
trò của quá trình sinh hóa trong sinh học .Trong hoàn cảnh hiện nay của Việt Nam,
để phát triển phƣơng pháp đánh dấu phóng xạ là rất khó khăn. Do vậy, việc phát
triển phƣơng pháp đánh dấu huỳnh quang hoặc đánh giá các tín hiệu thứ cấp

12


khi thụ thể hoạt động sinh ra hoàn toàn có thể phát triển và ứng dụng đƣợc trong
điều kiện thực tế của Việt Nam hiện nay [17].
Bên cạnh đó, xây dựng các hệ thống sàng lọc đơn giản hóa và tự động cần
đƣợc thiết lập trong các phòng thí nghiệm và tránh việc sử dụng các chất phóng xạ.
Hơn nữa, các hệ thống sàng lọc này sẽ cho phép phân biệt chức năng đơn giản giữa
các chất chủ vận, các chất đối vận và có khả năng ứng dụng cho phần lớn các thụ
thể. Do vậy, phƣơng pháp sàng lọc chức năng đối với thụ thể GABA đã phát triển

Máy đo OD, máy đo pH, máy khuấy từ, máy ly tâm, tủ hút, tủ đẩy, máy đọc
đĩa ELISA, máy lắc ổn nhiệt, máy đông khô, HPLC (Simazu) cùng nhiều thiết bị
khác của phòng enzym học và phân tích hoạt tính sinh học.
2.1.5. Các hóa chất, nguyên liệu khác
Agar, peptone, cao nấm men, glucose, cao thịt, CH 3COONa, Tri ammonium
citrate, MgSO4, Monosodium glutamate (MSG), Tween, CaCO3, Sucrose, Borate, 2mercaptoethanol, butanol, axít acetic, ninhydrin, methanol, acetonitrile, LaCl 3, ophthaldialdehyd, 1-butanol, K+pyrophosphate, ß-Nicotinamide adenine, NaCl,
dinucleotide phosphate hydrate, GABASE, α-ketoglutarate, NaI, GABA chuẩn,
kháng sinh (Sigma, Mỹ). DNAzol® Direct (invitrogen, Mỹ), GFX PCR, Gel Band
Purification Kit (Amersham Biosciences). CellTiter 96® Aqueous One Solution
Cell Proliferation Assay, Promega, Mỹ), Triton X-100, citrate, malate, Tripsin,

14


2-morpholinoethanesulfonic (MES), Pyridoxal 5-phosphate (PLP), succinate, axít
trichloroacetic (TCA), triethylamine, phenylisothiocyanate (Sigma, Mỹ). Fetal
bovine serum (FBS), môi trƣờng DMEM, (Invitrogen, Mỹ).
Sắc ký bản mỏng TLC (Meck), Ống Falcon các loại (50 ml, 15 ml), đĩa ELISA
96 giếng, đĩa nuôi tế bào 24 giếng, đĩa nuôi tế bào 12 giếng, đia ̃ petri vô trùng nuôi
cấy vi khuẩn và nuôi cấy tế bào (Corning, Mỹ). Bình nghiêng nuôi cấy tế bào, đầu
côn các loại (1 ml; 0,2 ml) và các ống eppendorf các loại (0,5 ml; 1,5 ml), pipet tiệt
trùng dùng trong nuôi cấy tế bào (1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml), Bình thủy tinh duran
các loại (Inovagen, Mỹ). Màng lọc vi khuẩn (Sigma, Đức).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo
2.2.1.1. Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1
Bảng 1: Thành phần môi trƣờng MRS
Công thức
Peptone
Cao thịt