ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Thu Hòa

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ HOẠT
TÍNH SINH HỌC BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Thu Hòa

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ HOẠT
TÍNH SINH HỌC BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN

Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Hoàng Thọ Tín

Hà Nội – 2011

1.2.2.5. Chống chỉ định ..................................................................................
1.2.2.6. Chú ý khi dùng ..................................................................................
1.2.2.7. Tương tác thuốc .................................................................................
1.2.2.8. Tác dụng phụ .....................................................................................
1.2.2.9.Liều lượng ..........................................................................................
1.2.2.10.Quá liều ............................................................................................
1.2.2.11.Bảo quản...........................................................................................
1.3. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng β-lactam
1.3.1. Phương pháp quang học ...........................................................................
1.3.2. Phương pháp điện hóa ..............................................................................
1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ...........................................................
1.3.4. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) ..............
1.4. Một số phƣơng pháp xác định Cefaclor
1.4.1. Phương pháp đo quang .............................................................................
1.4.2. Phương pháp điện hóa ..............................................................................
1.5. Giới thiệu về phƣơng pháp Von-ampe hòa tan (SV)
1.5.1. Nguyên tắc chung của phương pháp Von-ampe hòa tan ...........................


1.5.2.Các kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan .................................................
1.5.2.1.Kỹ thuật Von-ampe hòa tan quét tuyến tính ........................................
1.5.2.2.Kỹ thuật von-ampe xung vi phân DP ..................................................
1.5.2.3.Kỹ thuật von-ampe sóng vuông SqW ..................................................
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu 37
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất
2.2.1. Thiết bị.....................................................................................................
2.2.2. Dụng cụ....................................................................................................
2.2.3. Hoá chất ...................................................................................................
2.2.4. Chuẩn bị dung dịch ..................................................................................

3.5.1.Mẫu Cefaclor của công ty cổ phần hóa dược MEKOPHAR (MKP)...........
3.5.2. Mẫu Cefaclor của công ty cổ phần hóa dược phẩm TW 25 .......................
3.5.3. Mẫu CEFACLOR 125 mg ........................................................................
KẾT LUẬN 85
TÀI LIỆU THAM KHẢO


MỞ ĐẦU
Ra đời từ những năm 1970, là phương pháp có độ nhạy cao, định lượng
được nồng độ các chất trong khoảng từ 10 -7 – 10-8 M phương pháp điện hóa hòa tan
xác định được rất nhiều các kim loại và đặc biệt có thể xác định cùng lúc nhiều chất
mà không phải tiến hành tách hay che. Trong các phương pháp điện hóa hòa tan,
phương pháp von-ampe hòa tan có độ nhạy cao, kĩ thuật phân tích không quá phức
tạp, máy móc thiết bị phổ biến trong các phòng thí nghiệm lại không quá đắt tiền, có
độ lặp và độ chính xác cao.Ứng dụng chính của phương pháp này là: phân tích môi
trường, phân tích lâm sàng, phân tích thực phẩm. Đặc biệt là hướng ứng dụng mới
trong phân tích dược phẩm, mẫu sinh học bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp
phụ. Do số lượng lớn các hợp chất hữu cơ gồm các chất sinh học, dược học đều có
tính chất hoạt động bề mặt tốt nên đây là điều kiện thuận lợi để hấp phụ làm giàu
chúng lên bề mặt các điện cực. Giới hạn phát hiện rất thấp từ 10 -6 đến 10-10 M. Quá
trình này ứng dụng rất thành công trong việc định lượng lại các loại thuốc, dược
phẩm từ đó mở rộng vào việc xác định các mẫu sinh học hoặc xét nghiệm các mẫu
bệnh phẩm.
Tính đến những năm 70 người ta đã xác định rất nhiều các loại dược phẩm
khác nhau chứa nhóm sunfonamide và nitro, các loại này thuộc hơn 10 nhóm khác
nhau . Từ năm 1998 cho đến nay rất nhiều các loại dược phẩm đã phân tích được
bằng phương pháp điện hóa như các loại vitamin, thuốc kháng sinh, mocphin, các
họ thuốc β - lactam, quinolone…
Tuy quá trình ứng dụng phân tích điện hóa vào phân tích thuốc và mẫu sinh
học đã được làm nhiều trên thế giới nhưng ở Việt Nam vẫn còn tương đối mới mẻ,

Cấu trúc và phân loại:
* Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng βLactam

R

O
COOM

Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin
Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là:
(2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic
acid)
Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình
2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác
nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H.


Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác
nhau.

Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin

penicillinkhángpenicilliiase

Nhóm penicillin tự

Tên kháng sinh

phenyl-1,2-oxazole-4carbonyl)amino]

trên gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày
thế hệ I (CEP) và thế hệ III (CEF)

Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin
Thế hệ


I: Phổ

tác

bình, tác dụng mạnh nhất
trên vi
yếu nhất trên gram (-).
Không bền và dễ bị βlactamase phá hủy
III: Tác dụng tốt trên
khuẩn

gram

khuẩn

gram

dụng kém penicillin và
cephalosporin
Bền với β-lactamase

Tính chất:
Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam,
theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các
cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi
là kháng methicillin).
Độc tính:
Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị
ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc
phản vệ..
Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ
định dị ứng với thành phần của thuốc.
1.2. Giới thiệu về Cefaclor [6,7]


1.2.1. Đặc điểm của Cefaclor
Tên theo IUPAC : 3-chloro-7-D-(2-phenylglycinamido)-3-cephem- 4-carboxylic
acid monohydrate
Cấu trúc phân tử của Cefaclor

Công thức hóa học : C15H14ClN3O4S
Khối lượng phân tử : 367,8 g/mol
Công thức hóa học dạng monohidrat : C15H14ClN3O4S. H2O
Khối lượng phân tử : 385,8 g/mol
1.2.2.Tính chất, vai trò và ứng dụng của Cefaclor
Nhóm Dược lý: Thuốc trị ký sinh trùng, chống nhiễm khuẩn
:

Tên Biệt dược Dạng
:

bào chế

chung với thức ăn nồng độ đỉnh chỉ đạt được 50%-70% so với nồng độ đỉnh đạt
được khi bệnh nhân nhịn đói và đạt được chậm hơn khoảng 45-60 phút. Khi uống ở
tình trạng đói, sau khi dùng liều 250mg, 500mg, 1 g, nồng độ đỉnh trung bình trong
huyết thanh tương ứng là 7,13 và 23mg/L, đạt được sau 30-60 phút. Khoảng 6085% lượng thuốc được thải trừ dưới dạng không đổi trong nước tiểu trong vòng 8
giờ, một phần lớn thuốc được thải trừ trong 2 giờ đầu. Trong khoảng 8 giờ này,
nồng độ đỉnh trong nước tiểu tương ứng sau khi uống 250mg, 500mg, 1 g đạt được
là 600, 900 và 1900mg/L. Thời gian bán hủy trung bình trong huyết thanh ở người
bình thường khoảng 1 giờ (từ 0,6 đến 0,9). Ở bệnh nhân có chức năng thận suy
giảm, thời gian bán hủy thường kéo dài hơn một chút. Ở người suy giảm hoàn toàn
chức năng thận, thời gian bán hủy trong huyết thanh của dạng thuốc ban đầu là 2,3
đến 2,8 giờ. Ðường thải trừ thuốc ở bệnh nhân suy thận nặng chưa được xác định.
Lọc máu làm giảm thời gian bán hủy của thuốc khoảng 25-30%.
1.2.2.3. Tác dụng
Các thử nghiệm cho thấy rằng cephalosporin có tác dụng diệt khuẩn do ức chế
quá trình tổng hợp thành tế bào. Trong khi các thử nghiệm in vitro đã chứng minh
được tính nhạy cảm của phần lớn các chủng vi khuẩn sau đây với cefaclor, thì hiệu
quả lâm sàng đối với các chủng không được đề cập trong phần chỉ định lại chưa
được biết. Các vi khuẩn hiếu khí, gram dương như : Staphylococci, bao gồm chủng
tạo men penicillinase, coagulase dương tính, coagulase âm tính (khi được thử
nghiệm in vitro), có biểu hiện đề kháng chéo giữa cefaclor và methicillin, các vi
khuẩn hiếu khí, gram âm như Citrobacter diversus ,Escherichia coli ,Hemophilus
influenzae, bao gồm các chủng tạo men b-lactamase, kháng ampicillin... Các vi
khuẩn kị khí như Bacteroides spp (ngoại trừ Bacteroides fragilis), Peptococcus
niger.
1.2.2.4. Chỉ định
Cefaclor được sử dụng trong các trường hợp nhiễm vi khuẩn nhạy cảm với thuốc:
- Nhiễm trùng đường hô hấp trên


- Nhiễm khuẩn tai mũi họng, đặc biệt là viêm tai giữa, viêm xoang, viêm amidale.


Các nghiên cứu đầy đủ về mối liên hệ giữa tuổi và tác dụng của cefaclor
chưa được tiến hành ở trẻ sinh thiếu tháng và trẻ dưới một tháng tuổi. Tuy nhiên,
các ảnh hưởng đặc hiệu trên nhi khoa cho đến nay chưa được ghi nhận ở trẻ một
tháng tuổi hoặc lớn hơn.
Sử dụng trong lão khoa :
Cho đến nay chưa ghi nhận được ảnh hưởng đặc hiệu nào trên lão khoa khi
dùng cephalosporin ở người lớn tuổi. Tuy nhiên ở bệnh nhân lớn tuổi thường có
giảm chức năng thận liên quan đến tuổi nên có thể cần điều chỉnh liều và/hoặc
khoảng cách giữa liều nếu chỉ định cephalosporin cho các bệnh nhân này.
Sử dụng trong nha khoa :
Điều trị cephalosporin kéo dài có thể dẫn đến phát triển Candida albicans quá
mức, dẫn đến nấm candida miệng.
Sử dụng ở bệnh nhân suy gan/ suy thận :
Vì cefaclor không chuyển hóa ở gan, không cần điều chỉnh liều ở bệnh nhân
suy gan. Tuy nhiên, liều dùng phải được giảm ở bệnh nhân suy thận.
Lúc có thai :
Cefaclor thấm được qua nhau thai. Tuy nhiên những nghiên cứu trên động
vật cho thấy cefaclor không gây tác dụng phụ trên bào thai. Những nghiên cứu đầy
đủ và có kiểm tra ở người cho đến nay chứa được tiến hành. Cefaclor chỉ có thể
dùng ở phụ nữ có thai nếu có chỉ định rõ ràng.
Lúc nuôi con có bú :
Cefaclor khuếch tán vào sữa mẹ, thường ở nồng độ thấp. Tuy nhiên các ảnh
hưởng trên người cho đến nay chưa được báo cáo. Cefaclor chỉ có thể dùng ở phụ
nữ nuôi con bú nếu có chỉ định rõ ràng.
1.2.2.7. Tƣơng tác thuốc
- Dùng đồng thời cefaclor và warfarin hiếm khi gây tăng thời gian prothrombin và

điều chỉnh liều nếu cần thiết.
- Probenecid làm tăng nồng độ cefaclor trong huyết thanh.



- Cefaclor có thể dùng cho bệnh nhân suy thận, trong trường hợp này thường không

cần điều chỉnh liều. Trong điều trị nhiễm khuẩn do Streptococcusb tán huyết, nên
dùng Cefaclor ít nhất 10 ngày.
1.2.2.10.Quá liều
- Dấu hiệu và triệu chứng: Các triệu chứng ngộ độc khi dùng cefaclor có thể gồm:

buồn nôn, nôn, đau thượng vị, tiêu chảy. Mức độ đau thượng vị và tiêu chảy phụ
thuộc vào liều lượng. Nếu có thêm các triệu chứng khác, có thể là do phản ứng thứ
phát của một bệnh tiềm ẩn, của phản ứng dị ứng hay tác động của chứng ngộ độc
khác kèm theo.
- Ðiều trị: Ðể điều trị quá liều, cần cân nhắc đến khả năng quá liều của nhiều loại

thuốc, tương tác giữa các loại thuốc, dược động học bất thường của bệnh nhân.
Ngoại trừ trường hợp uống liều gấp 5 lần liều bình thường, không cần thiết phải áp
dụng biện pháp rửa dạ dày. Bảo vệ đường hô hấp của bệnh nhân, hỗ trợ thông khí và
truyền dịch. Theo dõi cẩn thận và duy trì các dấu hiệu sinh tồn của bệnh nhân, khí
máu, chất điện giải trong huyết thanh v.v. Có thể làm giảm sự hấp thu thuốc ở
đường tiêu hóa bằng than hoạt tính. Trong nhiều trường hợp, biện pháp này có hiệu
quả hơn gây nôn hoặc rửa dạ dày. Cân nhắc xem nên dùng than hoạt tính thay cho
rửa dạ dày hay phải kết hợp cả hai. Dùng nhiều liều liên tiếp than hoạt tính có thể
làm gia tăng sự đào thải thuốc đã được hấp thu. Cần bảo vệ đường hô hấp của người
bệnh khi áp dụng phương pháp rửa dạ dày hay dùng than hoạt tính. Các biện pháp
khác như dùng thuốc lợi tiểu mạnh, thẩm phân phúc mạc, lọc máu, thẩm tách máu
bằng than hoạt, chưa được xác định là có hiệu quả trong điều trị quá liều cefaclor.
1.2.2.11.Bảo quản
Bảo quản thuốc ở nhiệt độ phòng, 59 độ-86 độ F (15 độ-30 độ C). Nên cất
thuốc ở dạng dung dịch treo đã pha trong tủ lạnh. Vặn nắp chặt và lắc kỹ trước khi

luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích
một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao:
PEN là 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết quả
được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP
trong mẫu là 0.1 mg/l.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp,
các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng


sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân
tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân
tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.
1.3.2. Phƣơng pháp điện hóa
Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam
nhưng không phổ biến nhiều. Theo [25], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng
sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong
môi trường đệm axetat 0,1M pH=5,2.
Theo [23], các tác giả khẳng định cephalexin có thể xác định được bằng
phương pháp điện hóa trong cả môi trường axit và bazơ. Trong môi trường HCl
0,1M cephalexin được đo bằng phương pháp DPP có E pic = -1V, giới hạn phát hiện
LOD = 2,88.10-7M. Trong môi trường kiềm ở pH = 8,3 cephalexin được đo bằng
phương pháp DPP có Epic = -0,72V, giới hạn phát hiện đạt 2.10-7M.
Theo [34] các tác giả xử lí các kháng sinh cephalosporin trước khi đo bằng
cách cho tạo phức với các ion Cu (II), Pd(II) và Zn(II) sau đó đo von-ampe sóng
vuông thì thu được pic cao và rõ nét hơn rất nhiều. Giới hạn phát hiện LOD có thể
đạt 7.10-10M.
1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách

Tác giả Ngô Quang Trung [14] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6
kháng sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải
bệnh viện tại khu vực Hà Nội. Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x
4.6 mm, 5 µm, pha động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH
10%. Detector UV-VIS đo ở bước sóng 212 nm. Xây dựng đường chuẩn các kháng


sinh trong khoảng 0.1 – 1 mg/l, hệ số tương quan R > 99.8%. Giới hạn phát hiện
LOD và LOQ là 0.4 và 0.1 mg/l
Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ
dẫn… để phân tích các β-lactam.
Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như
thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp
đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu
và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ.
1.3.4. Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng
dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác
nhau.
L. Nozal, L. Arce ,A.Ríos, M. Valcárcel [29] sử dụng phương pháp điện di
mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện
di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5. Tiến hành phân tích tại thế điện di
10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng
sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong
mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ
lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15%.
Độ thu hồi trên 96%.
Biyang Deng và cộng sự [22] đã sử dụng phương pháp điện di với detector
điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp