BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
----------





---------- TRẦN THỊ THANH HẢO NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
KHÁNG SÂU vip3A LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT
Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn: 1. TS. CHU HOÀNG HÀ
2. GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH
Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học ñã giúp ñỡ và tạo ñiều
kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu ñề tài và
hoàn chỉnh luận văn.
Tôi cũng xin ñược trân trọng cảm ơn và GS.TS Nguyễn Quang Thạch,
trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người luôn theo dõi và hướng dẫn chu
ñáo ñể tôi hoàn thành bản luận văn này.
Qua ñây, tôi cũng chân thành cảm ơn tập thể cán bộ bộ phòng Sinh học
Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ
Sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, những người thân trong gia
ñình và bạn bè ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành bản
luận văn tốt nghiệp.
Tác giả luận văn
Trần Thị Thanh Hảo
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iiiMỤC LỤC
Lời cam ñoan Error! Bookmark not defined.

Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined.

Mục lục Error! Bookmark not defined.


2.1.3

Tình hình sâu bệnh hại 6

2.1.5

Giá trị của cây thuốc lá 7

2.1.6

Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 7

2.2.

Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 9

2.2.1

Khái niệm chuyển gen 9

2.2.2

Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 10

2.3

Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt) 19

2.3.1


Hoá chất, thiết bị 25

3.2

ðịa ñiểm và thời gian: 26

3.3

Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1

Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 26

3.3.2

Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens
bằng xung ñiện 31

3.3.3

Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens
(theo Topping, 1998 ) 31

3.3.4

Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 33

3.4


Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A 42

4.2

Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá 45

4.2.1

Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A. tumerfaciens
bằng xung ñiện 45

4.2.2

Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens 46

4.3

Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen 53

5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

5.1

Kết luận 57

5.2

Kiến nghị 57


MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
MT Môi trường
OD Optical density = mật ñộ quang học
PCR Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase
RM Môi trường ra rễ
RM Kan 50 Môi trường ra rễ chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l
RNA Ribonucleic Acid
TAE Tris bazơ - Axit acetic – EDTA
T-DNA Transfer - DNA = ñoạn DNA ñược chuyển
TE Tris HCl - EDTA, pH = 8
Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u
v/p Vòng/phút
vip Vegetative insecticidal protein = gen mã hoá protein sinh dưỡng
diệt côn trùng
vir Virulence region = vùng gây ñộc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
viDANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
2.1. Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới
giai ñoạn 2004 - 2008 8

2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008 9

4.1. Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A 38

4.2. Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn 49


4.8 Dịch huyền phù vi khuẩn 48

4.9 Mảnh lá CTTN trên MT GM Kan 30 50

4.10 Mảnh lá ð/C1 trên MT GM Kan 30 50

4.11 Mảnh lá ð/C2 trên MT GM 50

4.12 Cụm chồi CTTN trên MT GM Kan 50 50

4.13 Cụm chồi ð/C1 trên MT GM Kan 50 50

4.14 Cụm chồi ð/C2 trên MT GM 50

4.15 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 1) 51

4.16 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 2) 51

4.17 Cây ð/C trên MT RM Kan 50 51

4.18 Rễ cây chuyển gen trên môi trường RM Kan 50 51

4.19 Rễ cây ð/C trên môi trường RM Kan 50 51

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
viii4.20 Cây trong bầu trấu cát 53

kháng sâu (sâu xanh, sâu xám...). Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu của
cây bằng gen cry mã hóa cho sự tạo nội ñộc tố δ trong pha sinh bào tử của vi
khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gần ñây các nhà khoa học ñã phát hiện các
gen vip (vegetative insecticidal protein - các protein sinh dưỡng diệt côn trùng)
mã hóa cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn
Bt và Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác ñịnh trình tự và thử hoạt
tính sinh học. Kết quả cho thấy các protein Vip có hoạt lực và phổ tác dụng diệt
côn trùng cao hơn rất nhiều lần các protein do gen cry mã hóa. Gen vip3 tạo
protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA và có
phổ hoạt ñộng rộng như diệt ñược sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc lá [12].
Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày
có giá trị kinh tế cao [7]. Vấn ñề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những
nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu, do vậy ứng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
2dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại là một
trong những hướng ñi ñể giải quyết vấn ñề ñó.
Viện Công nghệ Sinh học ñã bước ñầu chuyển thành công gen kháng
bệnh vào cây thuốc lá (kháng bệnh khảm lá thuốc lá TMV, khảm lá dưa chuột
CMV)… [2] nhưng chưa có nghiên cứu nào ñược công bố về sử dụng gen vip3A
trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng sâu.
Trên cơ sở ñó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu tạo cây
thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A”
1.2 Mục ñích và yêu cầu
1.2.1 Mục tiêu của ñề tài:
Tạo ra cây thuốc lá chuyển gen mang gen kháng sâu (vip3A)
1.2.2 Nội dung nghiên cứu:
- Thiết kế vector chuyển gen mang gen vip3A.

0,6 - 1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental; còn lại là
các loại khác ñể sản xuất khoảng 6.000 tỷ ñiếu hàng năm [22], [47].
Theo Reed S. M. [41] thì cây thuốc lá ñược phân loại thuộc giới thực
vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt
kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có tới trên 85 chi
với tổng số trên 1.800 loài. Một số loài trong họ này ñược trồng rộng rãi như
khoai tây, cà chua, ớt, các loại cà và trong ñó có chi Nicotiana. ðặc trưng của
các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như solanin,
atropin, scopalamin, nicotine...
Chi Nicotiana ñược chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66
loài trong ñó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1
loài ở Châu Phi. Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là
cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ. Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài
chưa tìm thấy ở dạng hoang dại nhưng lại ñược trồng phổ biến làm thuốc lá là
Nicotiana tabacum (N. tabacum) và N. rustica.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
4Loài N. tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội
(Dihaploid = 4n), có biến ñộng lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc ñóng
lá so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc lá. Hoa tự chùm lưỡng tính mọc
trên ñỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng 5 cm, có 5 cánh với mầu từ hồng ñến
ñỏ (N. tabacum) hay màu vàng ñến vàng hơi xanh (N. rustica). Hoa thường
tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn ñến 95%. Mỗi cây có thể cho
200 - 400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000 - 4000 hạt. Trong
hạt chứa 32 - 42% dầu (Chủ yếu là Linoleic acid và Oleic acid), 20 - 30%
protein. Trong 1 gam hạt có từ 10.000 - 15.000 hạt và hạt có khả năng sống
rất lâu [16], [20], [22].
2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá

của rễ cái, thường có ñộ xiên 30 - 40
o
. Rễ hấp thu ñược phát triển trên các rễ
nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước và dinh dưỡng cho cây. Rễ bất ñịnh mọc
từ thân, những rễ bất ñịnh ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi ñộ ẩm
không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày ñặc ở lớp ñất 0 - 30 cm, phát triển
theo các hướng. Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin ñược
vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá.
2.1.2.2 Thân cây
Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân ñứng, tiết diện thân tròn, chiều
cao thân cây có thể ñạt từ 1 - 3 m, chia làm nhiều ñốt, mỗi ñốt mang một lá.
ðường kính thân ñạt 2 - 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là
chồi nách. Có 2 loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ.
2.1.2.3 Lá thuốc lá
Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay
ñổi tuỳ theo giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình
tim, hình elip, hình mũi mác. ðộ dày, màu sắc lá có thể thay ñổi.
Lớp ngoài của biểu bì có tầng cutin trong suốt và có lớp phấn sáp khi lá
bắt ñầu chín kỹ thuật. Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấu trúc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
6lá quyết ñịnh ñộ dày mỏng, ñộ ñàn hồi của lá thuốc. Ở trên mặt lá còn có
nhiều tuyến lông ña bào, có hình dạng và kích thước khác nhau. Các tuyến
này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín kỹ thuật.
Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ.
2.1.2.4 Hoa
Hoa thuốc lá là hoa ñơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung
quanh có 5 nhị ñực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn,


2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá
Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm
chính là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá
trên toàn thế giới. Ngoài ra thuốc lá còn ñược sử dụng vào một số mục ñích
khác như:
- Trồng nhóm Nicotiana rustica ñể chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ
4 - 5 % ñể sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin.
- Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất ñược sclareol và 13 epi - sclareol
chống bệnh gỉ sắt cây họ ñậu.
- Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp dược
phẩm.
- Hạt thuốc lá chiết xuất 34 - 40% dầu phục vụ trong công nghiệp, sử
dụng trong thực phẩm.
- Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao.
- Hoa chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá.
- Một số phát hiện mới hiện nay, các nhà nghiên cứu ñã kết luận thuốc
lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin.
- Protit thuốc lá chứa nhiều axit amin quan trọng, tính chất bổ dưỡng
vượt cả Phomat Protein trong sữa [5].
2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu
2.1.6.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá nguyên liệu của thế giới
Thuốc lá nguyên liệu tham gia thương mại trên thế giới chủ yếu ñược sản
xuất ở các vùng từ 45
o
vĩ Bắc ñến 30
o
vĩ Nam. Diện tích trồng thuốc lá trên thế
giới trong những năm gần ñây luôn duy trì ở mức khoảng 3,5 triệu ha [55].
Trong tổng sản lượng thuốc lá nguyên liệu trên 5 triệu tấn ñược sản xuất


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
9Bảng 2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008
Năm 2006 2007 2008
TT
ðịa ñiểm DT SL NS DT SL NS DT SL NS
I Phía Bắc 5.875 8.912 1,52 5.615 8.737 1,56 7.066 11.144 1,58
II Phía Nam 9.683 17.184 1,77 7.564 13.725 1,81 6.165 11.229 1,82
Tổng /TB 15.558 26.096 1,68 13.18 22.462 1,70 13.23 22.373 1,69
Nguồn tài liệu: Tổng công ty thuốc lá Việt Nam [15]
Ghi chú: DT: diện tích (ha); SL: sản lượng (tấn); NS: năng suất (tấn/ha)
Số liệu bảng trên cho thấy sản lượng thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong
nước trong những năm qua tương ñối ổn ñịnh. Theo ñánh giá của các chuyên
gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy của nước ta hiện nay có chất lượng tương ñối
tốt, có thể thay thế ñược nguyên liệu Trung Quốc. Vì vậy việc phát triển sản xuất
thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng nội ñịa
là một việc làm cần thiết trong giai ñoạn hiện nay. Nó vừa giúp cho ngành sản
xuất thuốc lá trong nước chủ ñộng ñược nguồn nguyên liệu ñầu vào vừa tạo công
ăn việc làm cho một bộ phận ñông ñảo bà con nông dân, tăng nguồn thu ngân
sách và tiết kiệm ñược nguồn ngoại tệ cho nhà nước.
2.2. Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài
2.2.1 Khái niệm chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết
kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật,...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các
gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện

trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do vậy, giảm tối thiểu sự không
biểu hiện của gen ñược chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả
chuyển gen cao; tránh ñược sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ
thuật ñơn giản, dễ thực hiện; không ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền [13].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
11Phương pháp này ñã khắc phục ñược những hạn chế chủ yếu của các
phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận ñược cây trồng có
nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen
trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu ñược những cây
mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây...
ðặc biệt là khi nhược ñiểm của A. tumerfaciens chỉ chuyển gen trên cây
hai lá mầm ñược khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành
hiện thực và ñược ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi
khuẩn Agrobacterium ngày càng gây ñược sự quan tâm và dần trở thành một
phương pháp chuyển gen ñược ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các
nhà chọn tạo giống trên thế giới.
* ðặc ñiểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens
Agrobacterium là các vi khuẩn ñất nhuộm gram (-) gây ra các triệu
chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương.
Trong chi Agrobacterium thì A. tumerfaciens ñược sử dụng nhiều nhất
cho việc chuyển gen.
Phân loại khoa học:
Giới Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Rhizobiaceae


Trên Ti-plasmit có ñoạn T-DNA ñược giới hạn bằng bờ phải (right
border) và bờ trái (left border) có trình tự nucleotid tương tự nhau. T-DNA là
ñoạn nucleotit có kích thước 25 kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư
(oncogenic gene), loại này mã hoá cho một enzyme liên quan tới tổng hợp các
auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên quan tới tổng hợp
opine. ðoạn này ñược gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì ñây là ñoạn sẽ ñược
chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh u. Trên Ti-plasmit
còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt ñộng lây nhiễm, chuyển
nạp và tiêu hoá opine [13].
Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt
ñầu hoạt ñộng và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng
của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u.
Opine ñược vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hoá
opine trên Ti-plasmit.
Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn:
Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất ñộc vết thương có bản chất
phenol: acetosyringon và hydroxyacetosyringon. Các chất này sẽ thu hút vi
khuẩn tập trung vào vùng bị thương ñồng thời chúng hoạt hoá các gen ở vùng
vir là E, D, C, G, B, A, F và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có
hai chức năng chính: cắt ñứt bờ phải và bờ trái ñể giải phóng ñoạn T-DNA,
bao bọc và vận chuyển ñoạn T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với
genom cây chủ.
Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A. tumerfaciens sang tế bào cây
chủ ñược thực hiện bởi hoạt ñộng của các gen vir A, B, C, D, E, G, F. Các
gen này có vai trò quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây
thông qua tín hiệu hoá học acetosyringon (AS). Tín hiệu hoá học ñược nhận
biết ñầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
14

bảo vệ T-DNA khỏi sự phân
giải của enzyme nuclease trong cây (Deng và cs 1998). ðồng thời thực hiện
chức năng này có các protein Vir C
1,
Vir C
2
có tác dụng tăng cường việc giải
phóng T-DNA.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
15Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B ñảm nhiệm. Vir B có
chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi ñơn T-DNA vào
nhân tế bào. ðồng thời protein Vir B
4
, Vir B
11
có hoạt tính ATPase cung cấp
năng lượng cho vận chuyển T-DNA (Zhu và cs 2000).
Như vậy, thực chất ñã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn ñất vào
cây trồng tồn tại trong tự nhiên.
Dựa vào cơ chế này con người lợi dụng vi khuẩn ñất ñể chuyển các gen
mong muốn cho mình trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmit của vi khuẩn
sao cho vẫn ñảm bảo ñược chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen
gây ñộc cho cây.
Người ta ñã tạo ra các dạng vector mới ñể chuyển gen là những vector
liên hợp (co-intergrate vector) và vector nhị thể (binary vector) [3], [4].
Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai
loại plasmit: Ti-plasmit ñã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất

ñã giúp các nhà khoa học thiết kế ñược những phân tử giúp chuyển gen mong
muốn vào tế bào thực vật: T-DNA ñược giới hạn hai ñầu bởi vùng biên (T-
DNA borders), phần còn lại trong vùng biên sẽ không có chức năng gì trong
quá trình chuyển gen. Nhờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA
bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong hai ñầu vùng biên
bằng các gen mong muốn. Khi các oncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực
vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho
cây hữu thụ. Quá trình tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây làm
ảnh hưởng ñến năng suất cuối cùng nên trong quá trình thiết kế cũng loại bỏ
các gen tổng hợp opine. Ti-plasmit có kích thước lớn (200 - 800 kb) nên
những ñoạn DNA không cần thiết cũng phải ñược cắt bỏ ñể chèn vào ñoạn
DNA mục tiêu. Ngoài ra, Ti-plasmit không tự tái bản trong E.coli nên cần
ñược bổ sung thêm gốc tái bản của E.coli. Cuối cùng, cần bổ sung các gen chỉ
thị ñể chọn lọc cây và vi khuẩn.
Các phân tử DNA kỹ thuật di truyền này ñược gọi chung là các vector.
Như vậy, cấu trúc của một vector chuyển gen bao gồm:
* Có gốc tái bản (ORI) có nguồn gốc từ vi khuẩn.
* Vùng khởi ñộng (promoter) có nguồn gốc từ thực vật.