BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
******
TRỊNH MINH HỢP
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN
ĐỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L.) KHÁNG
SÂU XANH (HELICOVERPA ARMIGERA HÜBNER)

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62. 62. 05. 01

HÀ NỘI - 2012
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam, bông là cây trồng truyền thống. Tuy nhiên, diện tích và sản
lượng rất thấp. Có nhiều nguyên nhân hạn chế mở rộng diện tích và tăng sản
lượng bông nước ta, nhưng quan trọng nhất vẫn là sâu hại. Trong số đó, sâu xanh
là loài nguy hiểm nhất, có mặt và gây hại nặng ở hầu hết các vùng trồng bông và
là đối tượng cần phòng trừ. Trong đó, biện pháp phòng trừ bằng giống kháng đã
được đặt ra. Tuy nhiên, đến nay, chúng ta vẫn chưa tạo ra giống kháng sâu tốt.
Theo Chương trình phát triển cây bông, Việt Nam cần phát triển theo
hướng tăng cường đầu tư thâm canh nâng cao năng suất, chất lượng, đảm bảo
hiệu quả kinh tế, nâng cao sức cạnh tranh của cây bông và bảo vệ môi trường
sinh thái; với chỉ tiêu đến năm 2015, đạt 20 nghìn tấn và đến 2020 là 60 nghìn
tấn bông xơ. Để thực hiện điều này, bên cạnh áp dụng các giải pháp quy hoạch,
đầu tư, tài chính…, thì giải pháp khoa học công nghệ mà trong đó ứng dụng
phương pháp chuyển gen để tạo giống bông Bt kháng sâu là rất cần thiết.
Xuất phát từ những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương
pháp chuyển gen để tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) kháng sâu xanh
(Helicoverpa armigera Hübner)” được tiến hành.
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học và phương
pháp cơ bản về tái sinh và chuyển gen cây bông; sàng lọc, đánh giá và chọn lọc
cây bông chuyển gen kháng sâu xanh; và góp phần phát triển lĩnh vực khoa học
chọn tạo giống cây trồng kháng sâu.
- Đưa kỹ thuật chuyển gen cây bông trở thành công cụ hỗ trợ đắc lực cho
công tác chọn tạo giống bông truyền thống và làm cơ sở áp dụng để chọn tạo các
loại giống cây trồng kháng sâu khác.
2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo ra dòng bông chuyển gen kháng sâu

lưới của Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Phòng Nghiên cứu Bảo vệ
Thực vật - Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố - Nhơn
Sơn - Ninh Sơn - Ninh Thuận; từ năm 2005 đến 2011.
5. Đóng góp mới của luận án
Lần đầu tiên ở Việt Nam: (i) Tái sinh thành công một số giống bông bằng
phương pháp tái sinh thông qua tạo phôi soma và tạo đa chồi; (ii) Chuyển thành
công gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương pháp chuyển gen thông
qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn; (iii) Tạo được
87 dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh. Đặc biệt, tạo được 50 dòng kháng sâu
cao làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước.

3
6. Cấu trúc của luận án
Luận án có 121 trang, gồm phần mở đầu, phần nội dung (3 chương), phần
kết luận và đề nghị; với 35 bảng số liệu, 22 hình, 12 phụ lục. Đã tham khảo 151
tài liệu, trong đó có 16 tài liệu tiếng Việt và 135 tài liệu tiếng Anh.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam
1.2. Sâu hại bông và tổn thất gây ra
1.3. Tình hình sản xuất, sử dụng bông chuyển gen và bông Bt kháng sâu
1.4. Ý nghĩa của trồng bông Bt kháng sâu
1.5. Sơ lược lịch sử khám phá gen Bt
1.6. Tái sinh cây bông
1.6.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma
Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma được sử dụng nhiều hơn tái sinh
thông qua tạo đa chồi, vì cây tái sinh có nguồn gốc từ tế bào đơn, nên tránh được
cây chuyển gen dạng khảm. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy mô cây bông bắt đầu
sớm nhất vào năm 1972 bởi Schenk và Hildebrandt (1972) và quy trình này được
xây dựng trong báo cáo tái sinh đầu tiên từ mô nuôi cấy của Davidonis và Hamilton

mầm giống Coker312, còn Firoozabady et al. chuyển vào mẫu mô lá mầm giống
Coker210. Họ sử dụng A. tumefaciens chủng LBA4404 chứa vector mang gen
nptII. Họ nhiễm mẫu mô với dung dịch vi khuẩn trong vài giây (Firoozabady et
al.) hoặc qua đêm (Umbeck et al.), sau đó, đồng nuôi cấy vi khuẩn và mẫu mô 3
ngày trên môi trường không chứa kháng sinh để kích thích vi khuẩn sinh trưởng.
Sau đó, mẫu mô được đặt lên môi trường MS chứa 50 mg/l kanamycin, 500 mg/l
cefotaxime (Umbeck et al.) hoặc 500 mg/l carbenicillin (Firoozabady et al.), 0,1
mg/l kinetin + 0,1 mg/l 2,4D và nuôi 4-6 tuần (Umbeck et al.) hoặc 5 mg/l 2iP +
0,1 mg/l NAA và nuôi 2-3 tuần (Firoozabady et al.) để cảm ứng mô sẹo chuyển
gen. Họ cảm ứng phân hóa phôi trên môi trường không chứa chất điều hòa sinh
trưởng, trong khi vẫn duy trì kháng sinh kanamycin và cefotaxime hoặc carbencillin.
Cây chuyển gen được tái sinh và ra rễ trên môi trường có nồng độ muối thấp,
không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (Umbeck et al.) hoặc có bổ sung 0,1
mg/l NAA + 0,1 mg/l GA
3
(Firoozabady et al.). Phương pháp chuyển gen này
được sử dụng rất rộng rãi, vì không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt, số bản sao gen
chuyển ít, di truyền ổn định, thao tác dễ dàng và chi phí thấp.
1.7.2. Chuyển gen
bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn (pollen
tube pathway - PTP): là chuyển trực tiếp gen vào tế bào mầm (germline cell).

Cơ chế của chuyển gen PTP: Sau khi hoàn thành quá trình thụ tinh kép,
một lượng lớn chất dinh dưỡng và năng lượng được yêu cầu cho sự phân chia
đầu tiên của hợp tử. Ở giai đoạn này, các tế bào có màng nhân, màng và thành tế
bào chưa hoàn chỉnh, nên trao đổi chất giữa các tế bào hợp tử và tế bào xung
quanh xảy ra thường xuyên. Vì vậy, có thể cho phép các đoạn DNA đi vào túi
phôi, hợp tử và kết hợp với genom theo một cơ chế chưa rõ ràng.
Tiến bộ của chuyển gen PTP ở cây bông: Từ năm 1993, Ni et al. (1996)
đã chuyển gen mã hóa Bt, Bt + CpTi, chitinase,

PCR và Southern blot xác định được sự có mặt, gắn kết và số bản sao gen
chuyển trong genom. Tuy nhiên, với thông tin này, chưa thể kết luận chuyển gen
thành công, vì gen chuyển cần phải hoạt động phiên mã và dịch mã. Ngày nay,
nhờ sự ra đời các phương pháp phân tích phân tử như
Northern blot và Western
blot
cho phép xác định các hoạt động này một cách nhanh chóng và chính xác.
1.8.4. Đánh giá tính kháng sâu của cây bông chuyển gen Bt
Kết quả xác định sự có mặt và gắn kết gen dương tính chỉ là điều kiện cần,
tính kháng sâu trên đồng ruộng mới là điều kiện đủ. Do đó, phân tích sinh học cần
thực hiện để chọn dòng chuyển gen kháng sâu cao. Đánh giá tính kháng sâu của
cây chuyển gen Bt ở 3 mức (i) trong phòng: sử dụng lá cây trong nhà lưới, nhà
kính để nuôi sâu; (ii) trong lồng lưới: trồng cây trong lồng lưới, thả sâu, điều tra
nụ và quả bị hại; và (iii) trên đồng ruộng: trồng cây trên đồng, điều tra mật độ sâu,
đo đếm mức độ và tỷ lệ đỉnh ngọn, nụ, quả bị hại để xác định mức độ kháng.

6
Chương 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống bông: Có 8 giống được sử dụng trong nghiên cứu là SSR60F,
Coker310, Coker312, VN36P, C118, LRA5166, MCU9 và TM1.
2.1.2. Gen, vector chuyển gen và chủng vi khuẩn: Gen CryIAc được thiết kế
trong 2 vector chuyển gen pC1300-Ubi-CryIAc (cho chuyển gen thông qua A.
tumefaciens) và pIBT-CryIAc (cho vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn).
Hai vector được biến nạp vào E.coli chủng DH5 và A. tumefaciens chủng C58.
2.1.3. Cặp mồi đặc hiệu: Sử dụng 3 cặp mồi đặc hiệu để PCR nhân gen hpt, nptII
và CryIAc. Trình tự 3 cặp mồi và kích thước 3 đoạn DNA nhân ở bảng 2.1.
2.1.4. Hoá chất: Ở phụ lục 1; 2.1.5. Máy móc, thiết bị: Ở phụ lục 2.
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi:
Cho 4 giống LRA5166,
VN36P, C118 và TM1 theo phương pháp của Banerjee et al. (2003) và Morre et al.
(1998). Gồm (a) Tạo nguyên liệu tái sinh, gồm khử trùng hạt theo phương pháp
ở mục 2.2.1.1-a, tách vỏ và lá mầm, thu phôi hạt; (b) Cảm ứng đa chồi trên 12
môi trường MSI gồm MSB
5
+ 20 g/l sucrose + 2,5 g/l gelrite + 12 tổ hợp nồng

7
độ 2,4D (0,1; 0,2 mg/l), BA (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l) và NAA (0,1 mg/l)
(bảng 2.4), nuôi 1 tuần; (c) Tạo cụm chồi trên 4 môi trường S gồm MSB
5
+ 30 g/l
sucrose + 8,5 g/l agar + 4 tổ hợp nồng độ BA (0,5; 1 mg/l) và NAA (0,05; 0,1
mg/l) (bảng 2.5), nuôi 4 tuần; (d) Kéo dài cụm chồi trên môi trường E gồm MSB
5

+ 30 g/l sucrose + 8,5 g/l agar, nuôi 9 tuần; (e) Tạo rễ - tái sinh cây hoàn chỉnh
trong ống nghiệm trên 4 môi trường R (bảng 2.6); (f) Huấn luyện, trồng cây tái
sinh trong nhà kính và nhà lưới theo phương pháp kết luận ở mục 2.2.1.1-g.
2.2.1.3. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens: cho 2 giống
Coker312 và SSR60F theo phương pháp của
Umbeck et al. (1987), gồm:

1) Xác định thông số chuyển gen: (a) Xác định nồng độ hygromycin chọn
lọc mô sẹo chuyển gen; (b) Xác định nồng độ cefotaxime ức chế A. tumefaciens;
(c) Xác định mật độ tế bào và thời gian nhiễm A. tumefaciens; và (d) Xác định
thời gian và nhiệt độ đồng nuôi cấy.
2) Thực hiện chuyển gen: (a) Cảm ứng mô sẹo chuyển gen trên môi trường

0
.

8
2.2.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen
2.2.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh: Gồm: (
1) Sàng lọc
cây bông chuyển gen bằng hygromycin: Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
và
T
2
bằng hygromycin; và (2) Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin:
Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
và T
2
bằng kanamycin.
2.2.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR: Đánh giá cây chuyển gen thế
hệ T
2
bằng PCR các gen hpt, nptII và CryIAc.
2.2.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây chuyển gen: Theo phương pháp
nuôi sâu đánh giá tính kháng trong phòng của Wang et al. (2004) có sửa đổi bởi
Phòng NC Bảo vệ Thực vật - Viện NC Bông và PTNN Nha Hố (phụ lục 10), gồm:
(1) Chuẩn bị sâu xanh; (2) Chuẩn bị lá bông; và (3) Nuôi thả cho sâu xanh ăn lá.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens
Để chuyển gen thông qua A. tumefaciens cần phải tái sinh được cây in

, CI
2
và CI
3
; về sau chúng bị loại bỏ.
- Cảm ứng phân hóa phôi: Kết quả mô sẹo đã phân hóa thành tiền phôi,
với tỷ lệ 29,5-100%. Trong đó, Coker310 có tỷ lệ phân hóa phôi cao nhất (84,8-
100%), kế đến Coker312 (52,3-86,7%) và thấp nhất là SSR60F (29,5-61,4%).
Các dòng mô sẹo CI
4
, CI
5
và CI
6
có tỷ lệ phân hóa phôi cao hơn các dòng mô

9
sẹo còn lại (bảng 3.3). Tiền phôi màu kem, kem trắng, kem vàng nhạt và vàng
xanh nhạt. Chúng có dạng viên tròn, kết cấu tơi xốp và rời rạc (hình 3.3.a và b).
a
c
b
d
Hình 3.3. Tiền phôi và phôi chín - a: tiền phôi hình thành trên môi trường
EI; b: tiền phôi soi trên kính hiển vi soi nổi; c: phôi chín trên môi trường
ED; và d: phôi chín soi trên kính hiển vi soi nổi - Hình chụp trên
giống Coker312.

10
- Phát triển và chín phôi: Cấy chuyển tiền phôi sang môi trường ED để phát

chồi cao nhất (70,6%). Hai môi trường MSI này được chọn để cảm ứng đa chồi.
Hình 3.7. Tạo và phát triển cụm chồi - a: đỉnh phôi cảm ứng 3 mm; b: cụm
chồi tạo thành trên môi trường S; c và d: cụm chồi phát triển sau 6 và 9 tuần
nuôi trên môi trường E - Hình chụp trên giống LRA5166.

a
b
c
d
S
1

S
2

S
3

S
412
- Tạo cụm chồi: Kết quả, 3 giống LRA5166, VN36P và C118 hình thành
cụm chồi (hình 3.7.b - S
1
-S
4
), TM1 không tạo được cụm chồi. Trong số 3 giống,
LRA5166 cho tỷ lệ tạo cụm chồi (38,0-76,0%) và số chồi/cụm (4,5-6,7 chồi/cụm)


59,3
17,4
19,9
0
5,4
3,6
3,9
S
3

58,4
23,2
11,1
0
5,1
3,5
4,2
S
4

38,0
24,8
8,7
0
4,5
3,4
3,3
- Kéo dài cụm chồi: Chồi con trên cụm chồi được phát triển kéo dài để có
chiều cao và số lá cần thiết bằng cách cấy chuyển sang môi trường kéo dài cụm


13
3.1.3.1. Xác định thông số chuyển gen
- Xác định nồng độ hygromycin: Kết quả ở bảng 3.10 và hình 3.9 cho thấy,
từ nồng độ 12,5 mg/l, đoạn thân không cảm ứng mô sẹo. Vì vậy, nồng độ này
được bổ sung vào môi trường CI
4
để cảm ứng mô sẹo chuyển gen. Kết quả cũng
cho thấy, ở nồng độ 10 mg/l, mô sẹo bị ức chế sinh trưởng hoàn toàn. Vì vậy, sử
dụng môi trường CP bổ sung 10 mg/l hygromycin để nhân mô sẹo chuyển gen.
Bảng 3.10. Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo trên môi trường CI
4
và mô sẹo sống sót
trên môi trường CP bổ sung hygromycin ở 6 nồng độ (tại Nha Hố, năm 2006)
Nồng độ
(mg/l)
Số đoạn
thân
Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo (%)
Tỷ lệ mô sẹo sống sót (%)
Coker312
SSR60F
Coker312
SSR60F
0-ĐC
90
100
100
100
100

- Xác định nồng độ cefotaxime: Số liệu ở bảng 3.11 cho thấy, nồng độ
500 mg/l cefotaxime không ảnh hưởng đến sự cảm ứng mô sẹo, tỷ lệ phân hóa
phôi giảm không đáng kể và ức chế hoàn toàn sinh trưởng của A. tumefaciens,
nên được chọn để chuyển gen.
- Xác định mật độ tế bào và thời gian nhiễm A. tumefaciens: Số liệu ở
bảng 3.12 cho thấy, mật độ OD
600
= 0,35 cho tỷ lệ cảm ứng mô sẹo chuyển gen
cao hơn và tỷ lệ nhiễm A. tumefaciens thấp hơn so với mật độ OD
600
= 0,7 ở cả 2
thời gian nhiễm 5 và 10 phút. Vì vậy, mật độ OD
600
= 0,35 và thời gian nhiễm
khuẩn 5-10 phút phù hợp nhất cho chuyển gen.
- Xác định thời gian và nhiệt độ đồng nuôi cấy: Kết quả ở bảng 3.13 cho
thấy, thời gian đồng nuôi cấy 48 giờ không bị nhiễm A. tumefaciens, có tỷ lệ cảm
ứng mô sẹo cao hơn, nên được chọn để chuyển gen. Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy,
đồng nuôi cấy ở 21
0
C cho tỷ lệ cảm ứng mô sẹo cao hơn. Ngoài ra, đồng nuôi cấy ở
nhiệt độ này, sinh trưởng của A. tumefaciens vừa phải, nên mẫu biến nạp không bị
nhiễm vi khuẩn. Vì vậy, chọn nhiệt độ đồng nuôi cấy 21
0
C là thích hợp nhất.
3.1.3.2. Thực hiện chuyển gen
- Cảm ứng mô sẹo chuyển gen: Sau khi nhiễm A. tumefaciens và đồng nuôi
cấy trên môi trường CI
4
, mẫu biến nạp được cảm ứng mô sẹo trên môi trường CI

24,2
24,3
10,7
11,0
1,01
0,84
Đợt 2
1.834
2.075
25,3
25,0
12,1
11,3
1,09
1,11
Đợt 3
2.238
2.006
26,8
25,5
11,6
10,9
1,16
1,25
TB
-
-
25,4
24,9
11,5


15
triển tốt, kiểu hình tương đồng giống gốc và hữu dục (hình 3.12.b). Tự thụ các cây
này để thu lấy hạt cung cấp cho sàng lọc, đánh giá cây chuyển gen ở thế hệ sau.
a
b
f
c
e
d
Hình 3.11. Nhân, chọn lọc mô sẹo; phân hóa, phát triển, chín phôi; nảy
mầm, tái sinh cây chuyển gen - Nhân mô sẹo chuyển gen lần 1 (a) và lần 2 (b);
phân hóa phôi chuyển gen (c); phôi chuyển gen chín (d); phôi chuyển gen nảy
mầm (e); và cây chuyển gen tái sinh (f) - Hình chụp trên giống Coker312. 16
3.2. Chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường
ống phấn: cho 4 giống C118, LRA5166, MCU9 và TM1.
3.2.1. Xác định thông số vi tiêm
- Xác định thời điểm vi tiêm trong ngày: Số liệu ở bảng 3.17 cho thấy, hoa
bắt đầu nở vào khoảng 6-7 giờ (12,2%), nở rộ vào 7-8 giờ (86,2%) và kết thúc nở
vào 8-9 giờ (1,6%). Từ kết quả này, đề tài kết luận, thời điểm vi tiêm thích hợp
nhất cho 4 giống bông là 6-8 giờ sáng của ngày sau ngày hoa nở.
- Xác định độ sâu kim tiêm: Dựa vào kích thước bầu nhụy, độ sâu kim tiêm
(bằng 3/4 chiều dài trụ noãn hoặc 2/3 chiều dài bầu nhụy) cho 4 giống là C118: 0,72-
0,73 cm, LRA5166: 0,62-0,64 cm, MCU9: 0,74-0,75 cm và TM1: 0,78-0,80 cm.
3.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T
0


11,79
20
1.259
1.123
89,20
12.713
11,32
30
1.460
1.299
88,97
15.506
11,94
Tổng/trung bình
4.000
3.567
89,18
41.713
11,69

LRA5166
10
1.234
1.132
91,73
14.345
12,67
20
1.452
1.309

643
503
78,23
5.295
10,53
Tổng/trung bình
1.995
1.654
82,91
18.107
10,95

TM1
10
1.356
1.157
85,32
11.794
10,19
20
1.439
1.260
87,56
9.095
7,22
30
1.400
1.263
90,21
10.682

3.3.1.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng hygromycin
- Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
bằng hygromycin: Gieo hạt 12 cây
chuyển gen thế hệ T
0
giống Coker312 và SSR60F trên môi trường G bổ sung 20
mg/l hygromycin. Kết quả, chọn được 7 dòng chuyển gen thế hệ T
1
(Coker312:
5 dòng và SSR60F: 2 dòng) kháng hygromycin, với tỷ lệ cây kháng 76,7-86,7%
(so với số hạt gieo) (bảng 3.23). Sau đó, trồng 7 dòng T
1
trong nhà lưới, chăm
sóc, thu hạt cho sàng lọc, đánh giá cây chuyển gen ở thế hệ T
2
.
Bảng 3.23. Số lượng (%) và tỷ lệ cây chuyển gen thế hệ T
1
kháng
hygromycin (tại Nha Hố, năm 2009)
Dòng/
giống
Số hạt
gieo
Số cây
kháng
Tỷ lệ
kháng
Dòng/

1
/3
30
26
86,7
S-T
1
/1
30
25
83,3
C-T
1
/4
30
-
0
S-T
1
/2
30
24
80,0
C-T
1
/5
30
26
86,7
S-T

gen thế hệ T
1
thành 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2
trong nhà lưới. Bôi dung dịch

18
hygromycin nồng độ 1.500 mg/l lên lá. Kết quả, lá của 7 dòng chuyển gen thế hệ
T
2
không bị tổn thương hay kháng hygromycin (hình 3.15.a), với tỷ lệ kháng
82,5-97,4% (bảng 3.24), trong khi, 2 ĐC (Coker312 và SSR60F) có 100% số
cây bị cháy lá. Tỷ lệ cây kháng hygromycin ở thế hệ T
2
cao hơn thế hệ T
1
.
3.3.1.2. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin
Bảng 3.25. Số lượng và tỷ lệ cây chuyển gen thế hệ T
1
, dòng chuyển gen thế
hệ T
2
kháng kanamycin (tại Nha Hố, năm 2008-2010)
Giống
Nồng
độ
(µg/ml)
Số
hạt T

Ka.
Tỷ lệ
dòng T
2

kháng
Ka. (%)

C118
10
13.494
9.695
71,85
108
1,11
0
0
20
12.713
7.687
60,47
133
1,73
0
0
30
15.506
9.671
62,37
426

30
18.569
9.901
53,32
121
1,22
7
0,07
Tổng/trung bình
53.004
23.182
43,74
388
1,67
7
0,03

MCU9
10
6.947
4.910
70,68
0
0
0
0
20
5.865
3.463
59,05

20
9.095
5.564
61,18
55
0,99
0
0
30
10.682
6.331
59,27
121
1,91
9
0,14
Tổng/trung bình
31.571
17.303
54,81
292
1,69
9
0,05
Tổng/
trung
bình 4
giống
10
46.580

- Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
bằng kanamycin: Gieo 144.395 hạt
chuyển gen thế hệ T
0
trong nhà lưới và thu được 79.321 cây chuyển gen thế hệ

19
T
1
, với tỷ lệ cây mọc 54,93%. Phun dung dịch kanamycin nồng độ 5.000 mg/l
lên lá (hình 3.16.a). Kết quả thu được 1.424 cây chuyển gen thế hệ T
1
kháng
kanamycin, với tỷ lệ cây kháng 1,8% (so với số cây mọc). Trong đó, C118 được
nhiều cây kháng nhất (667 cây; 2,47%), tiếp đến là LRA5166 (388 cây; 1,67%),
TM1 (292 cây; 1,69%) và MCU9 thu được ít cây nhất (77 cây; 0,69%) (bảng
3.25). Sau đó, nhổ bỏ cây mẫn cảm, giữ lại cây kháng (hình 3.16.c) và tiếp tục
chăm sóc, thu hạt cho sàng lọc, đánh giá cây chuyển gen ở thế hệ T
2
.
- Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
2
bằng kanamycin:
Gieo 1.424 cây
chuyển gen thế hệ T
1
thành 1.424 dòng T
2
(hình 3.17.a).

2
, với tỷ lệ
tương ứng 0,26% và 0,05% (bảng 3.25). Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 80 dòng
chuyển gen T
2
rất khác nhau và biến động lớn, 20-100%. Trong đó, tỷ lệ cây kháng
kanamycin của 7 dòng chuyển gen T
2
giống LRA5166: 38,4-100%; 64 dòng T
2

giống MCU9: 20-100%; và 9 dòng T
2
giống TM1: 42,6-99,1% (bảng 3.26, 27, 28).
Như vậy, kết quả sàng lọc bằng kháng sinh, thu được 87 dòng chuyển gen
thế hệ T
2
kháng kháng sinh, gồm 7 dòng kháng hygromycin (của Coker312 và
SSR60F) và 80 dòng kháng kanamycin (của LRA5166, MCU9 và TM1). Các dòng
này tiếp tục được đánh giá sự có mặt và gắn kết gen chuyển trong genom cây.
3.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR
Kết quả PCR nhân gen hpt cho 70 cây của 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2

kháng hygromycin (hình 3.18) cho thấy, trên các giếng ứng với cây chuyển gen
đều xuất hiện 1 băng duy nhất có kích thước 0,98 kb, tương đương kích thước
băng trên giếng ĐC+ (pC1300-Ubi-CryIAc), trong khi, trên giếng ĐC- (Coker312
không chuyển gen) không xuất hiện băng vạch nào. Kết quả khẳng định, có sự
hiện diện gen hpt trong tế bào 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2

2
kháng kanamycin. Kết
quả PCR cùng với kết quả xác định tính kháng kháng sinh và sự di truyền tính
kháng kháng sinh duy trì liên tục từ thế hệ T
0
, T
1
đến T
2
cho thấy, gen chuyển đã
gắn kết vào genom cây bông và di truyền bền vững cho thế hệ sau.
0,1 kb
0,6 kb
1,5 kb
Hình 3.20. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen CryIAc - 1: thang DNA 100
bp; 2: pIBT-CryIAc (ĐC+); 3: giống LRA5166 không chuyển gen (ĐC-); và
4-15: cây chuyển gen thế hệ T
2
.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1,1 kb

21
3.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây bông chuyển gen
Thu lá của 748 cây chuyển gen thế hệ T
2
nuôi sâu xanh đánh giá tính
kháng trong phòng. Kết quả thu được ở bảng 3.29, 30, 31 và 32 cho thấy, 87
dòng chuyển gen thế hệ T

2
/8 kháng trung bình.
3.3.3.2. Kết quả đánh giá tính kháng sâu xanh của 80 dòng chuyển gen thế
hệ T
2
giống LRA5166, MCU9 và TM1
- Tính kháng sâu của 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống LRA5166
: Kết
quả ở bảng 3.30 cho thấy,
7 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống LRA5166
đều
kháng sâu xanh cao, với tỷ lệ sâu chết 81,4-100%, trong khi, trên ĐC (LRA5166)
sâu không chết. Trong số đó, nổi bật nhất là dòng L-T
2
/21, L-T
2
/26 và L-T
2
/81
kháng sâu xanh rất cao, với tỷ lệ sâu chết lần lượt là 100%, 98% và 96,7%.
- Tính kháng sâu của 64 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống MCU9
: Số
liệu ở bảng 3.31 cho thấy, tỷ lệ sâu chết của
64 dòng chuyển gen thế hệ T

/73) kháng sâu rất cao, với tỷ lệ gây chết sâu xanh 95-100%.
- Tính kháng sâu của 9 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống TM1
: Tương
tự kết quả đánh giá tính kháng sâu của 64 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống
MCU9, tỷ lệ sâu chết của 9 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống TM1 cũng biến
động rất lớn, 50,0-93,3%, tương ứng với biến động mức độ kháng từ yếu đến cao,
trong khi, trên giống ĐC (TM1) sâu không chết. Trong số đó, có 5 dòng kháng
sâu cao là T-T
2
/19 và T-T
2
/34 (80,0%), T-T
2
/35 (87,5%), T-T
2
/46 (82,0%) và T-

22
T
2
/76 (93,3%); 3 dòng kháng trung bình là T-T
2
/26 (73,3%), T-T
2

tuổi 1 (53,4%) và tuổi 2 (17,1%); gây chết rất ít sâu tuổi 3 (2,0%) và tuổi 4
(0,04%); và không gây chết sâu tuổi 5. Trong khi, tỷ lệ sâu chết trên ĐC rất
thấp (tỷ lệ sâu chết tuổi 1 là 0,9%, tuổi 2: 0,2%, tuổi 3: 0,2% và không có sâu
tuổi 4-5 chết) (bảng 3.34).
Bảng 3.34. Tỷ lệ sâu chết và sống sót ở các tuổi khi ăn lá của 87 dòng
chuyển gen thế hệ T
2
(tại Nha Hố, năm 2009 và 2010)
Giống
Tỷ lệ sâu chết (%)
Tỷ lệ sâu sống (%)
T
1

T
2

T
3

T
4

Tổng
cộng
T
2

T
3

35,6
LRA5166
74,8
13,5
3,3
0,2
91,8
0,6
4,1
2,3
1,2
8,2
MCU9
64,9
12,7
2,1
0
79,7
3,6
10,4
5,8
0,5
20,3
TM1
57,7
17,5
1,5
0
76,7
10,8

23
Từ đặc tính gây chết sâu xanh, đề tài đề nghị, khi trên đồng ruộng tồn tại
sâu xanh tuổi 1-2, thì không cần phải sử dụng biện pháp phòng trừ, còn nếu tồn tại
sâu xanh tuổi 3-4, thì có thể cần phải phòng trừ bổ sung bằng thuốc hóa học để
bảo vệ cây bông chuyển gen Bt.
- Đặc
tính
ức chế sinh trưởng sâu: Ngoài đặc tính gây chết sâu, các dòng
chuyển gen thế hệ T
2
còn biểu hiện tính kháng sâu ở khả năng ức chế sinh
trưởng sâu. Kết quả số liệu thu được ở bảng 3.34 cho thấy, vẫn có sâu sống sót
khi ăn lá các dòng chuyển gen thế hệ T
2
, với tỷ lệ sâu sống trung bình là 27,5%.
Tuy nhiên, sâu sống sót chủ yếu ở tuổi 3 (11,8%), tuổi 4 (9,3%) và tuổi 2
(5,5%), rất ít sâu tuổi 5 sống sót (0,8%). Trong khi, trên ĐC, tất cả sâu sống qua
tuổi 4 (17,6%) và tuổi 5 (81,1%).
Kết quả nghiên cứu đặc tính kháng sâu xanh của các dòng chuyển gen
thế hệ T
2
tương tự kết quả của
Wang et al. (2004), cụ thể là “cây bông chuyển
gen Bt có độc tính cao với sâu tuổi nhỏ, ức chế sinh trưởng và phát triển sâu
sống sót” và “tỷ lệ chết của sâu mới nở và sâu tuổi 1 cao hơn, tỷ lệ chết của sâu
tuổi 2 và tuổi lớn hơn giảm đáng kể”.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1) Tái sinh thành công (i) 3 giống bông SSR60F, Coker310 và Coker312