CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35
CHƯƠNG 3
Nguyên liệu và phương pháp
Nguyên liệu và phương pháp
3.1
3.1
NGUYÊN LIỆU
NGUYÊN LIỆU
3.1.1 Vi sinh vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng Aspergillus awamori L1 được cung cấp
từ Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.
Chủng nấm sợi được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng, theo phương pháp cấy
chuyền đònh kỳ. Môi trường giữ giống được được sử dụng là môi trường Czapek (Xem phụ
lục A) [16]. Điều kiện bảo quản là 30
o
C. Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền liên tiếp là 3 tháng.
3.1.2 Môi trường nuôi cấy
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bột vỏ bưởi khô như nguồn carbon cho nấm
sợi sinh trưởng và tổng hợp pectinase. Bột vỏ bưởi khô được thu nhận bằng cách sấy khô vỏ
quả bưởi (Năm Roi, Tiền Giang) và nghiền thành bột có độ ẩm 7%.
Môi trường cơ bản nuôi cấy nấm mốc Aspergillus awamori L1 sinh tổng hợp pectinase
như sau (g/lít môi trường): hàm lượng pectin trong bột vỏ bưởi khô: 0.788; NH
4
NO
3
: 0.402;
KH
2
PO
4
: 4.0; Na

3.2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu
Giai đoạn 1
Khảo sát quá trình tinh sạch pectinase bằng phương pháp kết tủa với các
tác nhân sau:
- Dung môi hữu cơ: ethanol, isopropanol, acetone
- Polymer hữu cơ: PEG 4000, PEG 6000
- Muối vô cơ: (NH
4
)
2
SO
4
, NaCl
Chọn loại tác nhân cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch pectinase cao
để tiếp tục tinh sạch bằng lọc gel
Giai đoạn 2
Khảo sát tiếp hiệu quả tinh sạch pectinase bằng phương pháp sắc ký lọc
gel trên cột Sephadex G-75
Giai đoạn 3
Xác đònh một số tính chất đặc trưng của chế phẩm thu được:
- Hệ số K
m
và V
max
- Nhiệt độ và pH tối thích
- Độ bền nhiệt và pH của chế phẩm
So sánh tính chất của chế phẩm thu được với chế phẩm thương mại

Thực hiện:
– Chuẩn bò dung dòch enzyme thô và các dung môi: ethanol, isopropanol, acetone.
– Hút dung dòch enzyme (4
o
C) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung dung môi
(-18
o
C) với tỉ lệ như đã dự kiến. Để quá trình kết tủa enzyme hoàn toàn cần để yên
dung dòch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4
o
C.
– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4
o
C) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong 15
phút. Sau ly tâm, đổ bỏ phần dòch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dòch
đệm sodium acetate pH 4.5.
– Xác đònh hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được.
– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần.
2- Các polymer hữu cơ: PEG 6000 và PEG 4000
Nội dung:
– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với
polyethylene glycol (PEG-4000 và PEG-6000) ở các nồng độ khác nhau: 5%, 10%,
15%, 20%, 25%.
– Chọn loại PEG và tỉ lệ thích hợp để hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của
chế phẩm pectinase là cao nhất.
Thực hiện:
– Chuẩn bò dung dòch enzyme thô và các polymer hữu cơ (PEG-4000 và PEG-6000).
– Hút 10 mL dung dòch enzyme (4
o
C) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung tác

dòch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4
o
C.
– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4
o
C) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong 15
phút. Sau ly tâm, đổ bỏ phần dòch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dòch
đệm sodium acetate pH 4.5.
– Xác đònh hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được.
– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần.
3.2.2.2 Giai đoạn 2: Tinh sạch endo-PGase bằng phương
pháp lọc gel
Nội dung:
Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc
gel (Sephadex G-75), sử dụng chế phẩm pectinase thu được sau giai đoạn tinh sạch bằng
LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39
phương pháp kết tủa. Từ đó, đề xuất quy trình tinh sạch chế phẩm pectinase, sử dụng kết
hợp 2 phương pháp: kết tủa enzyme và sắc ký lọc gel.
Thực hiện:
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột sắc ký có
φ
=2 cm và l=50 cm. Cột được
nhồi bằng gel sephadex G-75. Phương pháp chuẩn bò cột và phân tích được trình bày trong
phần phụ lục C. Khi cột gel đã sẵn sàng, chúng tôi triển khai quá trình lọc gel theo từng
bước sau đây:
– Bước 1: Kết tủa dòch enzyme thô bằng các tác nhân như ethanol, isopropanol,
ammonium sulphate. Điều kiện thí nghiệm tương tự như đã trình bày trong phần
3.2.2.1. Sau khi kết tủa enzyme xong, hòa tan kết tủa vào một lượng thể tích nhất
đònh dung dòch đệm acetate 0.05N sao cho nồng độ enzyme dao động trong khoảng