NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
Ngày tháng năm
Giáo viên hướng dẫn
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
............................................................................................
Ngày tháng năm
Giáo viên phản biện

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
BK
TP.HCM
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá” nhằm khảo sát hoạt tính
của các enzyme trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) và nghiên cứu thu
nhận chế phẩm enzyme thô.
Các số liệu thực nghiệm về việc so sánh giữa mẫu nội tạng có mật và bỏ mật
cho thấy ở mẫu có mật hoạt tính riêng của enzyme amylase thấp hơn; hoạt tính
riêng enzyme protease cao hơn; và hoạt tính riêng của enzyme lipase thì cao hơn
mẫu bỏ mật.
Đáng chú ý là hoạt tính riêng lipase cao nên việc thu nhận chế phẩm tập trung
theo hướng tối ưu hóa điều kiện trích ly enzyme này.
Quá trình trích ly tiến hành ở nhiệt độ 30
0
C; thời gian trích ly là 2,5 h; pH dung
môi trích ly (dung dòch Na
2
CO
3
) là 9; tỷ lệ nội tạng và dung môi trích ly là 1 : 2,5
(theo khối lượng) thu được dòch trích ly có hoạt tính riêng của lipase cao nhất
1,4257 µmol/h.mg.
Sử dụng dung môi kết tủa là ethanol với tỷ lệ dòch trích ly và ethanol (theo thể
tích) là 50 : 50 cho tủa có hoạt tính riêng của lipase cao nhất là 7,5187 µmol/h.mg.
Trong quá trình bảo quản lạnh đông, hoạt tính riêng của enzyme lipase giảm
theo hàm số mũ (với y là hoạt tính riêng lipase, x là ngày bảo
quản).
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga
Trang iii
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM
MỤC LỤC
TRANG BÌA.................................................................................................................I
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN...............................................................................................

1.5.2 Enzyme amylase ..................................................................................... 32
1.5.3 Enzyme protease ................................................................................... 34
1.5.4 Enzyme lipase [11] ................................................................................. 34
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................................................................45
1.6 Nguyên liệu ................................................................................................... 46
1.7 Hóa chất ........................................................................................................ 46
1.8 Thiết bò sử dụng trong nghiên cứu ................................................................. 46
1.9 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 47
1.9.1 Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................... 47
1.9.2 Quy trình và thuyết minh ........................................................................ 48
1.10 Phương pháp xác đònh hàm lượng protein .................................................... 50
1.11 Phương pháp xác đònh hoạt tính enzyme ..................................................... 51
1.11.1 Hoạt tính enzyme amylase [2, 4] .......................................................... 51
1.11.2 Hoạt tính enzyme protease [1] ............................................................. 52
1.11.3 Hoạt tính enzyme lipase ....................................................................... 54
1.11.4 Hoạt tính riêng của enzyme ................................................................. 55
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.....................................................................................57
1.12 Xây dựng đường chuẩn ............................................................................... 58
1.13 So sánh mẫu có mật và không có mật ......................................................... 60
1.14 Tối ưu quá trình trích ly ............................................................................... 70
1.14.1 Khảo sát thời gian trích ly .................................................................... 70
1.14.2 Khảo sát tỷ lệ dung môi trích ly ........................................................... 74
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga
Trang v
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM
1.14.3 Khảo sát pH dung môi trích ly .............................................................. 78
1.14.4 Khảo sát nhiệt độ trích ly. ................................................................... 83
1.14.5 Tối ưu quá trình trích ly ........................................................................ 86
1.15 Khảo sát quá trình kết tủa thu enzyme thô .................................................. 91
1.16 Sự giảm hoạt tính của enzyme theo thời gian .............................................. 96

MẪU BM....................................................................................................................64
HÌNH 4.16. SO SÁNH HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE CỦA MẪU M, VÀ
MẪU BM....................................................................................................................65
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga
Trang vii
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM
HÌNH 4.17. SO SÁNH HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE CỦA MẪU M, VÀ MẪU
BM...............................................................................................................................66
HÌNH 4.18. SO SÁNH HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME CỦA MẪU M, VÀ MẪU
BM...............................................................................................................................69
HÌNH 4.19. SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH PROTEASE KIỀM Ở MỘT SỐ LOÀI
CÁ [19].......................................................................................................................70
HÌNH 4.20. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH
RIÊNG ENZYME LIPASE.......................................................................................74
HÌNH 4.21. ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NỘI TẠNG VÀ DUNG MÔI TRÍCH LY
ĐẾN HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME LIPASE......................................................78
HÌNH 4.22. ẢNH HƯỞNG CỦA PH DUNG MÔI TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH
RIÊNG ENZYME LIPASE.......................................................................................82
HÌNH 4.23. ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH
RIÊNG ENZYME......................................................................................................86
HÌNH 4.24. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TRÍCH LY, TỶ LỆ DUNG MÔI
TRÍCH LY VÀ NỘI TẠNG LÊN HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE.....................91
HÌNH 4.25. ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL LÊN
NỒNG ĐỘ PROTEIN TAN.......................................................................................93
HÌNH 4.26. ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL LÊN
HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE....................................................................94
HÌNH 4.27. ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL LÊN
HOẠT TÍNH RIÊNG CỦA ENZYME LIPASE. ....................................................96
DANH SÁCH BẢNG BIỂU
B NG 2.1. THÀNH PHẦN THỨC ĂN TRONG RUỘT CÁ TRA NGOÀI TỰẢ

B NG 4.17. SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO PH DUNG MÔIẢ
TRÍCH LY..................................................................................................................79
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga
Trang ix
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM
B NG 4.18. SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE THEO PH DUNG MÔIẢ
TRÍCH LY. ................................................................................................................81
B NG 4.19. SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO PH DUNGẢ
MÔI TRÍCH LY. .......................................................................................................82
B NG 4.20. SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO NHIỆT ĐỘ TRÍCHẢ
LY (T)..........................................................................................................................83
B NG 4.21. SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE THEO NHIỆT ĐỘ TRÍCHẢ
LY................................................................................................................................85
B NG 4.22. SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO NHIỆT ĐỘẢ
TRÍCH LY..................................................................................................................85
B NG 4.23. BỐ TRÍ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM.Ả ..........................................87
B NG 4.24. NỒNG ĐỘ PROTEIN.Ả ..........................................................................87
B NG 4.25. HOẠT TÍNH LIPASE.Ả ..........................................................................88
B NG 4.26. HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE.Ả ............................................................88
B NG 4.27. MA TRẬN QUY HOẠCH THỰC NGHIỆMẢ ......................................89
B NG 4.28. Ý NGHĨA CỦA CÁC HỆ SỐ ĐƯC KIỂM ĐỊNH THEO TIÊUẢ
CHUẨN T...................................................................................................................89
B NG 4.29. SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO TỶ LỆ DỊCH TRÍCHẢ
LY VÀ ETHANOL.....................................................................................................92
B NG 4.30. SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE THEO TỶ LỆ DỊCH TRÍCHẢ
LY VÀ ETHANOL.....................................................................................................94
B NG 4.31. SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO TỶ LỆ DỊCHẢ
TRÍCH LY VÀ ETHANOL.......................................................................................95
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga
Trang x

thu nhận enzyme từ phế liệu cá”. Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu các nội dung sau:
- Khảo sát hoạt tính của các enzyme trong nội tạng cá tra (Pangasius
hypophthalmus).
- Khảo sát các thông số của quá trình trích ly enzyme.
- Tối ưu hóa quá trình trích ly.
- Thu nhận chế phẩm enzyme thô.
Trang 2
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan
Tổng
quan
Trang 3
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan
1.1 Nguyên liệu
1.1.1 Cá da trơn
Phân loại khoa học
Gi i (ớ regnum) :
Animalia
Ngành (phylum) :
Chordata
L p (ớ class) :
Actinopterygii
Siêu bộ (superordo) :
Ostariophysi
B (ộ ordo) :
Siluriformes
Bộ Cá da trơn hay bộ Cá nheo (danh pháp khoa học: Siluriformes) là một
bộ cá rất đa dạng trong nhóm cá xương. Các loài cá trong bộ này đa dạng về kích
thước và cách thức sinh sống, gồm loài nặng nhất như cá tra dầu (Pangasius gigas)
ở Đông Nam Á, loài dài nhất như cá nheo châu Âu (Silurus glanis), những loài chỉ

ngược dòng sông Mê kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Khảo sát chu
kỳ di cư của cá tra ở đòa phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đến
tháng 5 và di cư về hạ lưu từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm.
 Hình thái, sinh lý
Trang 5
Phân loại khoa học [41]
Bộ cá da trơn :
Siluriformes
Họ cá tra :
Pangasiidae
Giống cá tra dầu :
Pangasius
Loài cá tra : Pangasius hypophthalmus (Sauvage 1878)
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan
Cá tra là cá da trơn (không vẩy), thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng
rộng, có 2 đôi râu dài. Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở
vùng nước hơi lợ (nồng độ muối 7-10 ), có thể chòu đựng được nước phèn với pH>5,
dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 15
o
C, nhưng chòu nóng tới 39
o
C. Cá tra có số lượng
hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác. Cá có cơ quan hô hấp phụ và còn
có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chòu đựng được môi trường nước thiếu oxy
hòa tan. Tiêu hao oxy và ngưỡng oxy của cá tra thấp hơn 3 lần so với cá mè trắng.
[2]
Cá tra có ngưỡng oxi thấp hơn cá basa (do cá basa không có cơ quan hô hấp
phụ), nên chòu đựng tốt hơn cá basa ở môi trường nước có hàm lượng oxy hòa tan
thấp. Nhìn chung cá tra chòu đựng được với môi trường khắc nghiệt hơn cá basa.
Cá tra ở ĐBSCL, chúng sống ở sông rạch, mương, ao, hồ vùng nước ngọt, sống

phần thức ăn khá đa dạng, trong đó cá tra ăn tạp thiên về động vật.
Bảng 2.1. Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên
Cá tra (Theo D.Menon và P.I.Cheko (1955))
Nhuyễn thể 35,4%
Cá nhỏ 31,8%
Côn trùng 18,2%
Thực vật dương đẳng 10,7%
Thực vật đa bào 1,6%
Giáp xác 2,3%
B ng ả 2.2. Khối lượng các phần khác nhau của cá tra.
Trọng lượng
cá (g)
Thành phần (%)
Fillet
không da
Da Thòt bụng Mỡ lá
Nội tạng
Đầu, xương,
vây, đuôi
550-700
755-845
850-950
980-1060
1105-1310
1356-1647
1695-1925
1985-2450
2570-2980
3050-3650
39.5

1.3
1.5
2.0
3.1
4.1
4.4
4.9
5.1
5.2
5.1
5.2
5.4
6.0
6.1
6.2
6.2
6.6
6.7
6.7
39.3
38.8
38.3
37.4
36.8
35.3
35.1
34.6
33.6
32.5
Trung bình 38.52 4.98 10.34 3.28

chuyên môn, hiện nay một kg phi-lê cá xuất khẩu có giá hơn 3 USD thì giá cá tra
mất phi-lê chỉ dao động ở mức từ 2.000 - 4.000 đồng/kg. Đây sẽ là một nguồn
nguyên liệu cho các ngành công nghiệp tận dụng.
1.1.4.2 Tận dụng phế liệu [44, 37]
 Cá tra sau khi lấy phi lê xuất khẩu thì phần còn lại gồm có da cá, mỡ cá,
đầu, xương, nội tạng … Hiện nay chúng đã và đang được nghiên cứu tận dụng
gần như toàn bộ.
Trang 8
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan
Da cá đang được nghiên cứu chế biến gelatin để sử dụng trong ngành
công nghiệp dược (làm vỏ thuốc con nhộng thay thế nguyên liệu da heo) và mỹ
phẩm.
Mỡ cá - chiếm từ 15 - 20% trọng lượng – ban đầu được các cơ sở chế
biến nấu thành mỡ nước cung ứng cho thò trường, sau đó được các doanh nghiệp
nghiên cứu để sản xuất 2 loại dầu: loại nhẹ có thể trích ly DHA (omega 3) sử dụng
trong công nghệ dược phẩm, thực phẩm; loại nặng sản xuất dầu biodiesel sử dụng
cho động cơ. Phải nhìn nhận là việc nghiên cứu sản xuất dầu biodiesel từ mỡ cá có
triển vọng rất lớn, phù hợp với xu thế thời đại bởi càng ngày nguồn nhiên liệu hoá
thạch (dầu mỏ, than đá...) càng cạn kiệt, nhu cầu sử dụng nhiên liệu tái tạo, không
gây ô nhiễm như dầu biodiesel là rất lớn. Thêm nữa, nghề nuôi cá tra, basa ở
ĐBSCL đang phát triển mạnh nên nguồn nguyên liệu phục vụ chế biến dầu
biodiesel rất dồi dào, các quốc gia lân cận không thể có được ưu thế này.
Đầu, xương sống, ruột … chế biến thành thức ăn công nghiệp phục vụ
chăn nuôi sau khi đã nấu lấy mỡ. Theo ông Trần Hữu Thích, giám đốc Công ty
STECG, với sản lượng nguyên liệu cá ước tính khoảng 700.000 tấn/năm, những
phụ phẩm của công nghệ chế biến cá (đầu, vi, bụng, xương) sẽ lên đến khoảng
450.000 - 480.000 tấn/năm. Từ 480.000 tấn phụ phẩm thô, chúng ta có thể làm ra
khoảng 96.000 tấn bột cá.
Bong bóng cá bán cho những đại lý chuyên thu mua sấy khô cung cấp
cho các nhà hàng nấu súp. Bao tử cá làm sạch bán cho các quán ăn đặc sản. Ngoài

tiêu hóa góp phần cần thiết vào trong quá trình này. Một vài enzyme tiêu hóa: [15]
 Enzyme pepsin được tiết dạng pepsinogen không hoạt động trong môi
trường HCl, nó được hoạt hóa thành pepsin. Pepsin tác động lên các
protein trong thức ăn tạo chuỗi peptit ngắn chứa khoảng 4-12 axit amin.
 Enzyme trypsin được bài tiết dưới dạng tiền enzyme trypsinogen, tiền
enzyme này gặp enzyme enterokinase của ruột thì biến thành trypsin
hoạt động (trypsinogen bò cắt mất 6 đoạn peptit sau cùng biến thành
trypsin). Trypsin lại có tác dụng tự xúc tác.
 Enzyme chymotrypsin của tụy cũng được bài tiết dưới dạng tiền enzyme
chymotrypsinogen. Tiền enzyme này gặp trypsin sẽ biến thành
chymotrypsin.
o Cả hai enzyme trypsin và chymotrypsin đều có tác dụng giống nhau, tức
là ở môi trường có độ pH gần bằng 8 thì hai men này thủy phân protein
thành các loại peptit. Riêng chymotrypsin còn có tác dụng gây đông sữa.
o Trong phần trên của tá tràng độ pH gần bằng 5 tức là không thuận lợi
lắm cho tác dụng của trypsin và chymotrypsin đối với protein, nhưng ở đó
hai enzyme này bền vững hơn là môi trường kiềm (môi trường kiềm dễ
làm phân hủy trypsin và chymotrypsin).
Trang 10
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan
 Enzyme cacboxypeptidase có tác dụng cắt các axit amin sau cùng có
mang - COOH của các chất peptit.
 Enzyme aminopeptidase cắt các axitamin có mang -NH
2
tự do ở cuối
mạch của các polipeptit.
 Enzyme lipase của tụy là một enzyme tiêu hóa mỡ rất mạnh. Tác dụng
của lipase là thủy phân mỡ thành một hỗn hợp glyxerit và axit béo
(glyxerit đơn giản: monoglyxerit).
 Enzyme amylase của tụy tác động lên tinh bột giống như enzyme ptyalin

C, pH tối ưu là
7,2. Nồng độ NaCl là cần thiết để hoạt hóa hoàn toàn amylase, đối với cá cao hơn
so với động vật có vú, với amylase của cá là 0,5 N. Tốc độ thủy phân tinh bột tỷ lệ
nghòch với nồng độ enzyme khi lượng enzyme quá lớn. [16, 19]
Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme amylase: thời gian thủy
phân càng dài thì hoạt tính enzyme càng giảm, tỉ lệ giữa enzyme và cơ chất, nhiệt
độ phản ứng, pH, nồng độ ion.[16, 19]
Trang 12
Dạ dày
Dòch dạ dày
HCl Pepsinogen+
Tế bào đỉnhTế bào vách
Pepsin
Tụy tạng
Dòch tụy tạng
Lipase
Amylase
Trypsin
Chymotrypsin
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan
Hình 2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme amylase.
Trục tung: 200-T (phút). Với T là thời gian phản ứng đến khi dung dòch
không còn cho màu xanh với thuốc thử iot.
x : amylase trong tuyến nước bọt của con người; : amylase trong tuyến tụy∆
của rùa nước ngọt; °: amylase trong tuyến tụy của cá mòi dầu.
Dưới cùng điều kiện phản ứng thì nhiệt độ tối ưu của enzyme amylase ở tuyến
nước bọt của người cao hơn trong tuyến tụy của rùa biển và cá mòi dầu.
Những yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ tối ưu của enzyme amylase trong hệ tiêu