CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ BÀN
KẾT QUẢ VÀ BÀNLUẬN
LUẬN
4.1
4.1
KHẢO SÁT TINH SẠCH PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT
KHẢO SÁT TINH SẠCH PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾTTỦA
TỦA
4.1.1 Kết tủa pectinase bởi các loại dung môi hữu cơ
Trong thí nghiệm này, chúng tôi thực hiện quá trình kết tủa pectinase từ dòch enzyme thô
sau 24 giờ nuôi cấy trong canh trường bề sâu (xem hình 4.1). Tại thời điểm này, hoạt tính
endo-PGase thu được là cao nhất và đạt giá trò 1.224
±
0.003U/mL. Nồng độ protein của
dòch enzyme tương ứng là 0.489
±
0.0006mg/mL. Sau quá trình ly tâm và lọc để tách tạp
chất thô và hệ sợi mốc, dòch enzyme thô sẽ được kết tủa lần lượt với các tác nhân ethanol,
isopropanol và acetone.
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45
0.0
0.2

(%)
Độ tinh
sạch
(lần)
10:90 0.078 1.144 14.609 92.21
b
5.77
b
20:80 0.074 1.204 16.294 97.02
a
6.43
a
30:70 0.068 1.005 14.678 80.96
c
5.79
b
40:60 0.052 0.287 5.493 23.15
d
2.17
e
50:50 0.009 0.123 13.673 7.95
e
4.32
c
60:40 0.004 0.036 9.321 2.90
f
3.69
d
Enzyme thô 0.489 1.244 2.544 100.00 1.00
Chú thích: Các giá trò có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không

:V
dung môi
Hiệu suất thu hồi, %
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Độ tinh sạch, lần
Hiệu suất thu hồi (%)
Độ tinh sạch
Hình 4.2 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm sau kết tủa bằng ethanol
Nhận xét: Từ kết quả thu được, chúng tôi có những nhận xét như sau:
– Nhìn chung, khi tăng thể tích ethanol sử dụng (tỷ lệ thể tích V
enzyme
:V
dung môi
thay đổi từ
60:40 đến 20:80) thì hàm lượng protein kết tủa cũng tăng dần (từ 0.004mg/mL đến
0.078mg/mL) và hiệu suất thu hồi enzyme cũng tăng dần (từ 2.9% đến 92.2%). Điều
này cho thấy rằng, khi nồng độ dung môi càng cao thì khả năng gây biến tính protein
càng rõ rệt. Nhờø đó, lượng protein bò kết tủa càng nhiều và tổng số đơn vò hoạt độ
thu hồi được cũng tăng lên. Tuy nhiên, nếu tăng tỷ lệ thể tích ethanol sử dụng lên
quá cao (tỷ lệ V

chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát thêm một vài tác nhân kết tủa khác để lựa chọn tác nhân
kết tủa enzyme tốt nhất.
4.1.1.2 Kết tủa endo-PGase bởi iso-propanol
Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dòch enzyme thô bằng isopropanol theo trình tự
đã trình bày trong phần 3.2.2.1. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2 và hình 4.3.
Bảng 4.2 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng iso-propanol
Tỷ lệ
V
enzyme
/ V
dung môi
Nồng độ
protein*
(mg/mL)
Hoạt tính
endo-Pgase*
(U/mL)
Hoạt tính riêng
(U/mg protein)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Độ tinh
sạch
(lần)
10:90 0.118 1.232 10.41 98.87
a
4.09
e
20:80 0.100 1.241 12.46 99.60

4.90
6.53
8.43
7.65
4.09
1.78
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
10:90 20:80 30:70 40:60 50:50 60:40
V
enzyme
:V
dung môi
Hiệu suất thu hồi, %
0
10
20
30
40
50
60

suất thu hồi enzyme và hoạt tính riêng của chế phẩm.
– Dựa trên khả năng tinh sạch chế phẩm và chi phí dung môi, chúng tôi quyết đònh
chọn tỷ lệ V
enzyme
:V
dung môi
= 40:60 để tinh sạch endo-PGase. Ở tỷ lệ này, độ tinh sạch
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 49
của chế phẩm là cao nhất (8.43 lần) và hiệu suất thu hồi hoạt tính chế phẩm là
88.95%.
4.1.1.3 Kết tủa endo-PGase bởi acetone
Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dòch enzyme thô với tác nhân là acetone theo
trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.1. Kết quả được trình bày trong bảng 4.3 và hình 4.4:
Bảng 4.3 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng acetone
Tỷ lệ
V
enzyme
/ V
dung môi
Nồng độ
protein*
(mg/mL)
Hoạt tính
endo-Pgase*
(U/mL)
Hoạt tính riêng
(U/mg protein)
Hiệu suất
thu hồi

d
Enzyme thô 0.489 1.244 2.544 100.00 1.00
Chú thích: Các giá trò có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không
có ý nghóa (α = 0,05).
(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dòch sau khi tái hòa tan kết tủa.
85.7%
96.8%
82.2%
35.4%
8.9%
6.8%
3.77
4.14
2.54
1.95
3.06
1.95
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
10:90 20:80 30:70 40:60 50:50 60:40
V

V
enzyme
:V
dung môi
thay đổi từ 40:60 đến 20:80. Ở tỷ lệ V
enzyme
:V
dung môi
= 10:90, hàm lượng
protein kết tủa tăng cao nhất nhưng hiệu suất thu hồi giảm do acetone gây biến tính
bất thuận nghòch một số phân tử enzyme. Tác động này cũng xảy ra tương tự với
trường hợp kết tủa bằng ethanol và isopropanol.
– Tỷ lệ V
enzyme
:V
dung môi
thích hợp để hiệu suất thu hồi endo-PGase cao nhất là 20:80.
Trong khi đó, độ tinh sạch của chế phẩm đạt được cao nhất khi V
enzyme
:V
dung môi
là
30:70.
– Từ những nhận xét trên, chúng tôi có kết luận sơ bộ như sau: So với 2 tác nhân
ethanol và isopropanol, acetone tỏ ra kém hiệu quả hơn trong quá trình tinh sạch
endo-PGase. Độ tinh sạch cao nhất đạt được trong trường hợp kết tủa với tác nhân
này (tỷ lệ V
enzyme
:V
dung môi

c
1.44
b
15% 0.021 0.058 2.82 4.77
c
1.18
c
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51
10% 0.028 0.083 2.97 6.77
b
1.24
bc
5% 0.031 0.084 2.72 6.85
b
1.16
c
Enzyme thô 0.511 1.222 2.39 100.00 1.00
Chú thích: Các giá trò có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không
có ý nghóa (α = 0,05).
(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dòch sau khi tái hòa tan kết tủa.
6.9%
6.8%
4.8%5.1%
8.7%
1.57
1.16
1.24
1.18
1.44

– PEG là dung môi có tính háo nước lớn. Khi bổ sung vào dung dòch chứa protein,
chúng có thể tương tác với lớp vỏ hydrate bao quanh phân tử protein và làm giảm
khả năng hòa tan của protein. Nhờ đó, các phân tử protein và enzyme sẽ kết tủa và
tách ra khỏi hỗn hợp.
– Tuy nhiên, nhược điểm PEG là làm tăng độ nhớt dòch enzyme, gây khó khăn cho
việc tách kết tủa ra khỏi dung dòch. Nếu sử dụng phương pháp lọc để phân riêng,
thời gian lọc sẽ kéo dài, còn nếu sử dụng phương pháp ly tâm thì phải tác động lên
dung dòch một lực ly tâm rất lớn. Điều này rất khó thực hiện khi triển khai ở quy mô
sản xuất lớn. Nếu lực ly tâm nhỏ thì có thể không thu hồi hết được lượng kết tủa.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thiết bò ly tâm có bán kính quay là 0.3m và
tốc độ quay là 5500vòng/phút, tương đương với gia tốc ly tâm làø 10000g (m/s
2
) nhưng
hiệu suất thu hồi pectinase chỉ dao động trong khoảng từ 4.8% đến 8.7%.
– Nhận xét về khả năng tinh sạch của chế phẩm, chúng tôi thấy rằng, độ tinh sạch
của chế phẩm tăng chỉ dao động từ 1.16 đến 1.57 lần.
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52
– Như vậy, theo đánh giá chung, hiệu quả sử dụng PEG để tinh sạch endo-PGase là
không cao.
4.1.2.2 Kết tủa endo-PGase bởi PG-4000
Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dòch enzyme thô với tác nhân là polyethylene
glycol (PEG 4000) theo trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.2. Kết quả thu được trình bày
trong bảng 4.5 và hình 4.6:
Bảng 4.5 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng PEG-4000
Nồng độ
tác nhân
Nồng độ
protein*
(mg/mL)

(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dòch sau khi tái hòa tan kết tủa.
12%
11%
7%
9%
1.33
1.02
1.42
1.30
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
25% 20% 15% 10%
Nồng độ tác nhân, %
Hiệu suất thu hồi, %
0
10
20
30
40
50
60

(U/mL)
Hoạt tính riêng
(U/mg protein)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Độ tinh
sạch
(lần)
35%
0.049 0.607
12.29 48.87
a
5.30
a
30% 0.057 0.417 7.27 33.55
b
3.14
c
25% 0.098 0.347 3.55 27.94
c
1.53
e
20% 0.040 0.280 6.98 22.52
d
3.01
d
15% 0.036 0.232 6.37 18.65
e
3.46

Hiệu suất thu hồi, %
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Độ tinh sạch, lần
Hiệu suất thu hồi (%)
Độ tinh sạch
Hình 4.7 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch chế phẩm sau kết tủa bằng sodium chloride
Nhận xét:
– Sodium chloride có ưu điểm nổi bật là giá thành rẻ và khả năng gây biến tính bất
thuận nghòch protein thấp. Khi sử dụng tác nhân này để kết tủa endo-PGase, hiệu
suất thu hồi enzyme tăng dần từ 18.65% đến 48.87% khi hàm lượng NaCl tăng từ
10% đến giá trò nồng độ bão hòa (35%). Độ tinh sạch của chế phẩm cũng đạt giá trò
cao nhất là 5.30 lần tại nồng độ NaCl bão hòa.
– Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi chọn ra nồng độ sodium chloride thích hợp để kết
tủa endo-PGase là 35%.
– Tuy nhiên, nếu so sánh với kết quả thu được với phương pháp kết tủa bằng tác nhân
dung môi hữu cơ thì hiệu suất thu hồi hoạt tính pectinase đạt được trong thí nghiệm
này vẫn thấp hơn nhiều.
4.1.3.2 Kết tủa endo-PGase bởi ammonium sulphate
(NH
4

(%)
Độ tinh
sạch
(lần)
100% 0.088 1.059 12.03 85.68
a
4.87
d
90% 0.085 1.041 12.24 84.22
b
4.95
c
80% 0.078 0.998 12.75 80.78
c
5.16
b
70% 0.074 0.966 12.94 78.17
d
5.26
a
60% 0.078 0.829 10.63 67.07
e
4.30
e
50% 0.046 0.336 7.34 27.21
f
2.97
f
40% 0.042 0.206 4.96 16.67
g

2.01
4.87
4.3
5.26
5.16
4.95
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40%
Độ bão hoà, %
Hiệu suất thu hồi, %
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90