I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây cà chua bị tấn công bởi rất nhiều loài virus. Trong số bệnh virus hại cà chua ở vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh quan trọng nhất (Pico et al., 1996).
Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua khá phức tạp. Bệnh được xem là một bệnh phức,
có nghĩa là một bệnh nhưng do nhiều virus thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae gây ra
(Moriones & Navas-Castillo, 2000). Các begomovirus có hình thái phân tử dạng hình cầu kép (hình
chuỳ), không truyền qua hạt giống nhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia
tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Pico et al., 1996).
Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb.
Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân tử
DNA-A và DNA-B). Cấu trúc của một phân tử DNA-A điển hình gồm có 6 gien được sắp xếp theo
hai chiều ngược nhau (Hình 1). Theo chiều kim đồng hồ có hai gien AV1 và AV2. Gen AV1(CP)
mã hóa vỏ protein, qui định tính đặc hiệu vector và nhập nhân tế bào. Gen AV2 mã hóa 1 protein
có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus. Ngược chiều
kim đồng hồ có 4 gien AC1, AC2, AC3 và AC4. Gien AC1 (Rep) mã hóa 1 protein có vai trò quan
trọng trong quá trình tái sinh virus và tương tác với các protein ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào.
Gien AC2 (TrAP) mã hóa 1 protein hoạt hóa phiên mã và ức chế phản ứng phòng thủ của cây. Gien
AC4 (REn) mã hóa 1 protein tăng cường sự tái sinh virus và tương tác với các protein ký chủ điều
khiển chu kỳ tế bào. Gien AC4 mã hóa 1 protein có chức năng cảm ứng triệu chứng và di chuyển
hệ thống (Stanley et al., 2005)
Hiện nay, có tới hơn 50 begomovirus phân lập từ cà chua (có từ tomato ở đầu tên virus) đã
được công bố trên thế giới (Fauquet et al., 2008). Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu
chứng giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng;
lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus gây bệnh chỉ có thể
biết được dựa vào các phân tích phân tử (Moriones & Navas-Castillo, 2000).
Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất trên cà chua với tỉ lệ
nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi tới 100 %. Bệnh đã được phát hiện
thấy trên cà chua từ những năm 80. Một số nghiên cứu về tạo kháng huyết thanh chẩn đoán, lây
nhiễm nhân tạo đã được thực hiện trong thời gian này nhưng bản chất thật sự của virus vẫn chưa
rõ. Gần đây, dựa vào các phân tích phân tử, có ít nhất 3 begomovirus được phát hiện gây ra bệnh

trong đó thành phần chủ chốt là tiêu diệt bọ phấn, cắt nguồn ký chủ của virus, nhổ bỏ cây bệnh, sử
dụng giống kháng (Czosnek, 2007). Việc xác định đầy đủ thành phần begomovirus trên cà chua
luôn cần thiết cho bất cứ chiến lược phòng chống nào
1.2. Mục đích và yêu cầu
Mục đích: Xác định thành phần loài Begomovirus hại cà chua tại Hà Nội và phụ cận.
Yêu cầu:
− Thu mẫu và xử lý mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá.
− Xác định sự có mặt của các begomovirus bằng PCR dùng mồi chung (degenerate primers) đặc
hiệu cho DNA-A của virus .
− Xác định thành phần begomovirus tại các điểm điểu tra dùng cặp mồi đặc hiệu với 2 loài virus
đã được xác định trước tại miền Bắc là tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) và tomato
yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV).
− Giải trình tự sản phẩm PCR của các mẫu virus có khả năng là loài mới.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thu mẫu và xử lý mẫu
Mẫu bệnh cây cà chua có triệu chứng điển hình của bệnh xoăn vàng lá được thu thập tại các
ruộng trồng thuộc Hà Nội và phụ cận.
Mẫu sau khi thu thập được số liệu hóa và xử lý khô bằng silicagel hoặc sấy ở 37
O
C. Mẫu sau
khi xử lý khô được bảo quản lâu dài trong lọ chứa silicagel ở 4
O
C.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
Nghiên cứu được thực hiện từ 24/06/2008 đến 15/01/2009 tại TT BCNĐ, ĐHNNHN
2.3. Chiết DNA từ mô lá cà chua
DNA tổng số từ mô lá được chiết theo 2 phương pháp:
Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang et al., 1993): Cho khoảng 50 mg mô lá cà
chua vào tube 1,5 mL. Cho 0,5 mL dung dich NaOH 0,5 M vào tube. Dùng chày nhựa chuyên dụng
để nghiền nhuyễn mẫu lá. Hòa loãng dịch nghiền 50 - 100 lần với đệm Tris 0,1 M, pH = 8 (5 μL

chup bằng máy ảnh số.
2.5. Mồi PCR
Ba cặp mồi đã được sử dụng trong nghiên cứu. Chi tiết của các mồi được trình bày ở Bảng 1 và
Hình 2.
Căp mồi thứ nhất là cặp mồi chung (universal/degenerate primers) BegoAFor1 / BegoARev1.
Cặp mồi này được thiết kế trên vùng bảo thủ của gien CP và Rep và đã được chứng minh có khả
năng phát hiện DNA-A của nhiều begomovirus (Ha et al., 2006, 2008)
Hai cặp mồi còn lại là các mồi đặc hiệu cho TYLCVNV (TYLCVNV-sp-F
1
/

TYLCVNV-sp-
R
1
) và ToLCVV (ToLCVV-sp-F
2
/

ToLCVV-sp-R
2
). Các mồi này đã được thiết kế dựa trên trình tự
chuỗi gien đã công bố của 2 virus này.
Bảng 1. Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu
Mồi Trình tự (5’ – 3’) Vị trí
Kích
thước
(bp)
Tham khảo
TYLCVNV-Sp-
F1

* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T) và i =
inosine

3

2.6. Giải trình tự
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLink
TM
Quick Gel
Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng
bằng điện di agarose với lượng DNA tham khảo là 2µl, 1µl, 0.5µl tương ứng với 1µg, 0.5 µg, 0.25
µg DNA (marker GeneRuler, Fermantas).
Sản phẩm PCR tinh chiết được giải trình tự trực tiếp cả 2 chiều bằng mồi PCR tại Viện Công
nghệ sinh học (Hà Nội)
2.7. Phân tích trình tự và xây dựng cây phả hệ.
Các chuỗi mẫu được xác định danh tính khi so sánh với các chuỗi đã công bố từ trước nhờ
phần mềm tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Phân tích chuỗi và xây dựng cây phả hệ được thực hiện với các phần mềm miễn phí BioEdit
7.0, ClustalX1.83, Mega 4.0 và gói phần mềm thương mại DNASTAR.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Điều tra thu thập mẫu bệnh
Chúng tôi đã tiến hành điều tra bệnh xoăn vàng lá trên các ruộng trồng cà chua thuộc Hà Nội,
Bắc Ninh và Hưng Yên. Tổng số 50 mẫu cà chua đã được thu thập, số liệu hóa và xử lý khô để bảo
quản lâu dài. Các mẫu này đều tạo triệu chứng đặc trưng của bệnh xoăn vàng lá.
3.2. Kiểm tra PCR dùng mồi đặc hiệu begomovirrus
Do số lượng mẫu thu thập khá lớn nên chúng tôi đã chọn 19 mẫu bệnh đại diện cho các địa
điểm khác nhau để kiểm tra PCR. Đầu tiên, chúng tôi sử dụng cặp mồi chung đặc hiệu cho DNA-A
của nhiều loài begomovirus (BegoaFor1/BegoARev1) nhằm phát hiện sự có mặt của virus trong
mẫu cây bệnh. Phản ứng PCR đều tạo ra 1 sản phẩm có kích thước khoảng 1200 bp trên tất cả 19

Quan trọng nhất là chúng tôi đã phát hiện 2 mẫu (mẫu số 9, thu tại Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội
và mẫu số 14, thu tại Yên Mỹ – Thanh Trì – Hà Nội) có phản ứng PCR (–) với cả hai cặp mồi. Kết
quả này gợi ý rằng các begomovirus nhiễm trên 2 mẫu này có thể không phải là ToLCVV hay
TYLCVNV. Tuy nhiên danh tính của chúng chỉ thể được xác định dựa trên phân tích trình tự chuỗi
gien virus.

Bảng 2. Kiểm tra PCR các mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá
TT
*
Mã
mẫu
Địa điểm thu mẫu
PCR đặc hiệu
Begomoviru
s
ToLCVV TYLCVNV
1 CC1 Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội. + – +
2 CC2 Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội. + + –
3 CC 3 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội. + + –
4 CC 4 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội. + + –
5 CC 5 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội. + + –
6 CC 6 Từ Sơn – Bắc Ninh. + + –
7 CC 7 Từ Sơn – Bắc Ninh. + + –
8 CC 8 Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội + + –
9 CC 9 Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội + – –
10 CC 10 Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội + + –
5