Chương 4
Một số phương pháp phát hiện
các biến dị di truyền ở mức phân tử
Trong thế kỷ 20 người ta mới bắt đầu nghiên cứu về các biến dị của
gene, hậu quả của các đột biến tích lũy theo thời gian. Sự đánh giá và đo
lường các biến dị này trong quần thể và trong các gia đình có ý nghĩa rất
quan trọng trong việc lập bản đồ gen nhằm xác định vị trí đặc hiệu của
chúng trên các NST. Đây cũng là chìa khóa để xác định chức năng của gen
và đặt cơ sở cho các chẩn đoán di truyền. Dưới đây sẽ mô tả các phương
pháp đã được sử dụng để phát hiện các biến dị di truyền ở người.
I. Điện di protein (protein electrophoresis)
Kỹ thuật này phát triển đầu tiên vào thập niên 1930 và được áp dụng
rộng rãi ở người vào các thập niên 1950 và 1960 cho phép phát hiện một
cách đáng kể tính chất đa hình (polymorphism) ở người. Kỹ thuật này dựa
trên nguyên tắc sự khác biệt của chỉ một amino acid trong phân tử protein
xảy ra do đột biến trên DNA sẽ có thể gây ra một sự khác biệt nhẹ trong
điện tích của protein. Ví dụ như trong bệnh hồng cầu hình liềm sự thay thế
glutamic acid bằng valine trong chuỗi beta globin sẽ làm thay đổi điện tích
của chuỗi globin vì glutamic acid có hai nhóm carboxyl trong khi đó
valine chỉ có một nhóm carboxyl.
Điện di có thể được sử dụng để xác định một người có Hb bình
thường (HbA) hay mang Hb bị đột biến gây bệnh hồng cầu hình liềm
(HbS). Hemoglobin được cho vào trong khay gel gồm (tinh bột, agarose
và polyacrylamide) để chạy điện di. Do có sự khác biệt trong điện tích nên
HbS và HbA sẽ di chuyển với các tốc dộ khác nhau trên gel. Sau khi cho
chạy điện di trên gel trong nhiều giờ chúng được nhuộm bằng dịch hóa
chất để có thể thấy được vị trí của chúng trên khay gel. Căn cứ sự phân bố
của chúng trên khay gel để xác định người đó đồng hợp tử HbA, đồng hợp
tử HbS hay dị hợp tử (HbA/HbS). (hình 1)
Điện di protein đã được dùng để phát hiện các biến dị amino acid

đoạn DNA giới hạn (Restriction
Fragment Length Polymorphism:
RFLPs)
Nỗ lực đầu tiên trong việc
phát hiện các biến dị di truyền ở
mức độ DNA đựoc thực hiện
thông qua vai trò của các enzyme
của vi khuẩn được gọi là các
enzyme giới hạn (restriction
endonuclease/restriction enzyme).
Các enzyme này được sản xuất bởi
nhiều loại vi khuẩn khác nhau
nhằm mục đích ngăn chặn sự xâm
nhập của các DNA lạ bằng cách
cắt nhỏ những DNA này. Các
DNA lạ sẽ được cắt tại những vị trí
đặc hiệu trên DNA được gọi là
những vị trí ghi nhận hay vị trí
Hình 1: Kỹ thuật điện di protein

2

giới hạn (recognition sites/restriction sites).
Ví dụ: Ở Escherichia coli (một loại vi khuẩn có trong ruột) có một
enzyme giới hạn EcoRI ghi nhận một đoạn DNA có trình tự GAATTC.
Mỗi khi bắt gặp đoạn này ở trên DNA thì EcoRI sẽ cắt giữa vị trí G và A
dẫn đến việc tạo thành các đoạn DNA giới hạn.

Hình 2: Cắt DNA bằng enzyme giới hạn EcoRI
Giả sử có một đoạn DNA với chiều dài khoảng vài ngàn nucleotide

tương tự như vị trí của chúng
ở trên gel và được gọi là màng
thấm Southern (Southern
Blot).
(5) Xác định đoạn DNA đặc
hiệu
Nếu người ta nhìn tất cả
các đoạn này một lần trên
màng lai sẽ khó phân biệt
chúng với nhau do số lượng
các đoạn DNA trên đó quá
lớn. Vì vậy để có thể nhận
định sự có mặt của các đoạn
DNA đặc hiệu người ta dựa
vào nguyên tắc bổ sung.
Một mẫu dò (probe) đặc
hiệu được tạo ra nhờ kỹ thuật
DNA tái kết hợp (recombinant
DNA) mang một đoạn mạch
đơn DNA đặc hiệu có chiều
dài khoảng vài ngàn bp và
được đánh dấu bằng chất đồng
vị phóng xạ.
Màng thấm sẽ được cho
tiếp xúc với hàng ngàn probe
có hoạt tính phóng xạ. Trong
những điều kiện nhất định quá
trình bắt cặp theo nguyên tắc
bổ sung giữa các probe và các
đoạn DNA đặc hiệu tương ứng

loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tượng này đã tạo ra sự đa dạng trong
chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gel, chuyển lên
trên màng lai và dùng các probe đặc hiệu có hoạt tính phóng xạ để phát
hiện thì có thể đánh giá được các biến dị này.
Hình 4: Hình phóng xạ tự chụp cho thấy vị trí
của 1 band 4,1kb và 1 band 3,3kb. Mỗi dãy đại
diện cho một thành viên trong gia đình trong gia
hệ trên hình phóng xạ tự chụp
Quay trở lại với trường hợp bệnh hồng cầu hình liềm, ở người bình
thường tại vị trí thứ 6 của chuỗi polypeptide globin bêta trong cấu trúc của
phân tử Hb là glutamic acid. Amino acid được mã hóa trên gene bằng
codon GAG. Trong bệnh hồng cầu hình liềm acid này được thay bằng
valin, mã hóa trên gene bằng codon GTG. Enzym giói hạn Mst II ghi nhận
đoạn DNA CCTNAGG (N nghĩa là enzyme này có thể ghi nhận bất cứ
loại base nào của DNA tại vị trí đó). Như vậy nó sẽ cắt đoạn DNA bình
thường tại vị trí này cũng như ở các vị trí giới hạn tương tự nằm ở hai bên
vị trí này. Kết quả là Mst II sẽ tạo ra hai đoạn DNA, một đoạn có chiều dài
1100 bp và một đoạn có chiều dài 200 bp. Ở các DNA mang đột biến thay
GAG bằng GTG làm Mst II không ghi nhận được đoạn giới hạn đó nữa

5