ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------------------------------- LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC
HYDROCACBON THƠM
CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU
TẠI QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. NGHIÊM NGỌC MINH
Thái nguyên - 2008
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lêi c¶m ¬n!
Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS.
Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và
chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công
nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS. Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn
Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của
mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa,
các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Sư
Phạm - Đại Học Thái Nguyên.
1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .............8
1.1.1. Tính chất hóa lý ..................................................................8
1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hƣởng của nó tới môi trƣờng
sống .............................................................................................10
1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH ..........................................................13
1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam ...........13
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh ............................................................14
1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH ................................................15
1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý ..............................................................16
1.3.2. Phƣơng pháp phân hủy sinh học ...........................................16
1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật ..................................19
1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH ...................................................19
1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV ...........................................21
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất
hydrocarbon thơm đa nhân .................................................................25
1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật ........................................29
1.6.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống ...................................29
1.6.2. Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử .....................30
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................33
2.1. Nguyên liệu và hóa chất .............................................................. 33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1.1. Nguyên liệu.........................................................................33
2.1.2. Hóa chất .............................................................................33
2.2. Môi trƣờng nuôi cấy....................................................................33
2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ...................................................34
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................34
2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nƣớc nhiễm dầu ......................34
2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số
chủng vi khuẩn .............................................................................35
2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn......................36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
bp Base pair (cặp bazơ)
USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ
môi trường Hoa Kỳ)
LB Luria-Bertani
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
POP Persistent Organic Pollutant
DNA Deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
VSV Vi sinh vật
X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
μl Microlit
μm Micromet
PAH
Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa
nhân)
ppm đơn vị một phần triệu (mg/l)
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH ......................................... 9
Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH ................. 20
Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của
chủng BQN31........................................................................................... 50
Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 ................................................ 51
Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng
được lựa chọn ........................................................................................... 52
Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 ............................... 53
Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng
vi khuẩn BQN31....................................................................................... 53
Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 ........... 54
Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen
mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại
diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000
nucleotide so sánh..................................................................................... 55
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4
Hình 3.12: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol
2,3-dioxygenaza từ DNA tổng số chủng BQN31 và cặp mồi C23OF
và C23OR ................................................................................................ 58
Hình 3.13: Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn
gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng
Sphingomonas sp. BQN31 ........................................................................ 58
Hình 3.14: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen
mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas
sp. BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện
một nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh ................................ 59 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6
Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh,
ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH
4
NO
3
) thì sự có mặt của dầu và một
số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra
đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để. Hiện
nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử
dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng… Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi
chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp.
Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học
đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành
thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi
trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập
trung nghiên cứu về điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả
năng phân hủy PAH của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật.
Các gen tham gia quá trình phân hủy sinh học PAH cũng được quan trắc trong
quá trình xử lý, của các tập đoàn VSV bản địa và trong các nghiên cứu phân
hủy PAH ở điều kiện phòng thí nghiệm. Catechol là một trong các sản phẩm
trung gian của quá trình phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm, do vậy
các gen mã hóa các enzym chuyển hóa catechol được nhiều nhà nghiên cứu
quan tâm.
Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên
cứu và thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng
phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được
phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh”.
PAH là những chất kỵ nước. Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy
thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước [16], [48]. Đặc
điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng
đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển.
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon
thơm đa nhân (PAH)
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
9
Số lượng vòng benzen trong cấu trúc hóa học của các PAH quyết định khả
năng hòa tan của các PAH trong nước. PAH giảm khả năng hòa tan trong
nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [54]. Khả năng
hòa tan của các PAH rất biến động, từ những chất khó hòa tan nhất là
benzo(b)perylen có chỉ số hòa tan là 0,003 mg/l cho đến chất dễ hòa tan nhất
là naphthalen có chỉ số hòa tan tới 31 mg/l. Nếu khả năng hòa tan trong nước
của PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp
phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích, do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khả
trong
nước
(mg/l)
LogKp
d
Áp suất
hơi ở
20
o
C
(torr)
Phenanthrene 3 101 340 1,29 4,45 6,8x10
-4
Anthracene 3 216 340 0,07 4,46 2,0x10
-4
Fluoranthene 4 111 250 0,26 5,33 6,0x10
-6
Benzo[a]anthracene 4 158 400 0,24 5,61 5,0x10
-9
Pyrene 4 149 360 0,14 5,32 6,8x10
-7
Chrysene 4 255 488 0,02 5,61 6,3x10
-7
Benzo[a]pyrene (BaP) 5 179 496 0,0038 6,04 5,0x10
-7
Dibenzo[a]anthracene 5 262 524 0,0005 5,97 1,0x10
-10
phân tử, hóa học lập thể và các phản ứng xảy ra trong quá trình trao đổi chất,
các nguyên tố mang điện tích mà có ảnh hưởng đến sự gắn kết của các sản
phẩm trao đổi chất với các đại phân tử là DNA, RNA. Một số nghiên cứu
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
11
khác đã đưa ra kết luận: các PAH có khối lượng phân tử nhỏ, cấu tạo phân tử
chỉ có một, hai, ba vòng thơm là rất độc, trong khi các PAH có khối lượng
phân tử lớn lại có thể gây độc ở mức độ gen, hoặc gây ra đột biến, bởi chúng
có khả năng gắn vào các phân tử DNA, RNA, hoặc protein, gây nên những
biến đổi ở mức phân tử [16], [42].
Naphthalene là một chất ô nhiễm thuộc nhóm PAH gây ảnh hưởng tới
một loạt các cơ quan như phổi, thận và kìm hãm quá trình hô hấp. Nhiễm độc
naphthalene ở người dẫn tới bệnh thiếu máu và viêm thận. Ngoài ra, sự thay
đổi về da và mắt ở những người bị phơi nhiễm naphthalen cũng đã được công
nhận. Phenanthrene được biết như chất cảm quang với da người, chất gây dị
ứng với động vật, đột biến tới hệ thống vi khuẩn trong các điều kiện đặc biệt.
Chất này gây yếu các nhiễm sắc thể tương đồng và kìm hãm sự nối liền các kẽ
hở gian bào. Ngoài ra, các PAH khác như acenaphthalene, fluoranthene,
fluorene đều gây độc cho động và thực vật. Độc tính của benzo(a)pyrene,
benzo(a)anthracene, benzo(b)fluoranthrene, benzo(k)fluoranthrene, dibenzen
(a,h)anthracene và indenol(1,2,3-c,d)pyrene đã được nghiên cứu chứng minh
gây ung thư cho người. Trong tự nhiên hiếm khi bắt gặp các PAH đơn lẻ mà
chỉ gặp chúng ở dạng hỗn hợp nhiều PAH, do đó độc tính của chúng càng
được tăng cường [53].
PAH thâm nhập gián tiếp vào cơ thể con người thông qua chuỗi thức
ăn, đường hô hấp hoặc qua sự tiếp xúc trực tiếp với nguồn ô nhiễm, gây ung
thư, đột biến gen. Rất nhiều PAH có chứa “vùng bay” và vùng tương tự nó
“vùng K”. Cả hai vùng này đều cho phép trao đổi chất, tạo ra dạng liên kết
“epoxit-vùng bay” và “epoxit- vùng K” có khả năng hoạt động cao và một số
đe dọa tới sức khỏe con người và môi trường biển thông qua các tác động trực
tiếp hoặc qua các chuỗi thức ăn trong chu trình vật chất [61].
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13
Do tính độc hại như vậy, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã
xếp PAH vào danh sách một trong những chất ô nhiễm điển hình và đã tiến
hành kiểm định sự có mặt của PAH trong hệ sinh thái dưới nước cũng như
trên cạn [16], [53].
1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH
1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam
Các hydrocarbon thơm đa nhân đã được tìm thấy ở nhiều môi trường
sinh thái khác nhau, kể cả môi trường không khí. Trong môi trường nước,
PAH phân bố rộng rãi. Người ta ước tính, hàng năm có khoảng 2,3x10
5
tấn
các hợp chất này đã xâm nhập vào các hệ sinh thái dưới nước. Đặc biệt, với
hệ sinh thái bị ô nhiễm PAH vùng ven bờ biển thường có nguồn gốc từ phế
thải và công nghiệp hóa dầu, công nghiệp khai thác và vận chuyển dầu mỏ,
nước thải công nghiệp và sinh hoạt, cháy rừng và cháy đồng cỏ [61]. Người ta
đã định lượng được nồng độ BaP trong nước uống là 0,0002 đến 0,024 g/l.
Trong 90 mẫu nước kiểm tra ở Mỹ cho thấy nồng độ của 6 PAH từ 0,001 đến
0,01 g/l, 1% mẫu nước kiểm tra cho thấy nồng độ trung bình lớn hơn 0,1
g/l [31].
Nhiều công trình nghiên cứu còn cho thấy, sự có mặt của PAH trong
các mẫu trầm tích với nồng độ đáng kể. Một số nơi có mức độ ô nhiễm PAH
rất cao: nồng độ các hợp chất PAH ở vịnh Boston (Mỹ) có thể lên tới 100.000
ng/g. Nguyên nhân chủ yếu là do trong môi trường biển hầu hết các hợp chất
PAH hòa tan kém trong nước đã dẫn đến việc chúng được tích lũy trong các
lớp trầm tích [31].
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh của PAH, nhưng chúng đều
có bản chất chung là do các quá trình đốt cháy không hoàn toàn các vật liệu
hữu cơ trong tự nhiên hay cho hoạt động sản xuất của con người. Trong tự
nhiên, PAH được phát sinh là từ các quá trình địa chất tự nhiên, hóa lỏng khí
than, các vụ cháy đồng cỏ, cháy rừng thậm chí trong các trận mưa [16], [28],
[31], [38].
Con người cũng có thể gián tiếp hay trực tiếp làm phát sinh PAH vào
môi trường từ việc đốt nhiên liệu (than đá, dầu diesen, ...) trong sinh hoạt hay
trong sản xuất (đốt nhiên liệu cho các phương tiện máy móc có động cơ, quá
trình đốt rác tại các nhà lò đốt). Các vụ tràn dầu do sự cố hay trong quá trình
vận chuyển cũng làm phát sinh một lượng đáng kể PAH vào môi trường [31].
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
15
Tại các nước công nghiệp phát triển, các hoạt động có liên quan đến
đốt cháy tạo ra một lượng lớn PAH. Các PAH này được tích tụ lại trong đất
và làm tăng nồng độ PAH nhanh chóng trong vòng 100 -150 năm trở lại đây
[31].
PAH là nhóm hợp chất độc, nhưng chúng lại khá quan trọng trong công
nghiệp, đặc biệt trong các ngành công nghiệp dược, nhuộm, sản xuất đồ nhựa
và sản xuất thuốc trừ sâu [31]: naphthalene, anthracene, phenanthrene thường
được sử dụng trong công nghiệp sản xuất thuốc nhuộm. Naphthalene cũng
được dùng như thuốc xông diệt bướm trong các gia đình. Đặc biệt,
phenanthrene cũng được ứng dụng trong công nghiệp dược dùng để sản xuất
thuốc ngủ. Ở New York (Mỹ), hỗn hợp phenanthrene và anthracene được sử
dụng để chống rỉ cho những thiết bị trữ nước [31]. Benzo[a]pyrene được sử
dụng để hạn chế muội và khói, trong công nghệ quét hắc ín, hay còn sử dụng
để liên kết các phần tích điện lại với nhau. Người ta cũng có thể tìm thấy
trong hợp chất Creosote, một chất hóa học được sử dụng làm chất bảo quản
hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ
20 W/cm
3
ở nhiệt độ 20
o
C trong thời gian 3 ngày [25]. Tuy nhiên, những
phương pháp trên có nhược điểm là không có tác dụng với lớp đất có độ sâu
dưới vài milimet, do đó chỉ xử lý được lớp đất rất mỏng trên bề mặt [49].
Mặc dù làm sạch PAH có thể được tiến hành bằng nhiều biện pháp lý
hóa đã nêu ở trên, nhưng các phương pháp này có nhược điểm là gây ô nhiễm
thứ cấp nên không an toàn và không xử lý triệt để. Mặt khác, giá thành của
việc sử dụng các phương pháp đó l ại cao nên xu hướng sử dụng chúng ngày
càng giảm.
1.3.2. Phương pháp phân hủy sinh học
Hiện nay, phương pháp sinh học đang bắt đầu được quan tâm bởi tính
an toàn và hiệu quả không những về mặt công nghệ mà còn về kinh tế. Chìa
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
17
khóa của công nghệ phân hủy sinh học là thúc đẩy tập đoàn vi sinh vật bản
địa tham gia vào quá trình phân hủy ở mức cao nhất. Các nghiên cứu cơ bản
đều nhằm mục đích thúc đẩy hiệu quả quá trình tẩy độc thông qua việc kích
thích tập đoàn vi sinh vật trong các điều kiện phân hủy khác nhau tạo ra kết
quả cuối cùng là các sản phẩm ít độc hoặc hoàn toàn không độc. Chính vì vậy,
công nghệ phân hủy sinh học đã trở thành công nghệ thân thiện với môi
trường.
Phương pháp phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học trên thế giới
nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đã đạt được khá
nhiều thành tựu. Công nghệ sinh học đảm bảo an toàn cho môi trường hơn tất
cả các công nghệ khác. Đặc biệt, trong điều kiện sinh thái đa hệ, việc áp dụng
, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v.
Kích thích sinh học hiện là khuynh hướng được sử dụng rộng rãi trong
xử lý ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học [26]. Trong hoạt động
sống, vi sinh vật cần nguyên tố N, P, một số chất dinh dưỡng khác và các điều
kiện sống thích hợp. Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những
chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PAH, nghiên cứu các đặc tính sinh lý,
sinh hóa của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng
dụng cho việc kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa
trong việc phân hủy sinh học PAH tại vùng ô nhiễm. Để tăng cường quá trình
phân hủy sinh học, việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như nguồn cacbon,
nitơ, photpho theo phải theo tỷ lệ nhất định đã đề cập ở phần trên là C:N:P =
100:10:1. Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng cần điều chỉnh thích hợp, đảm
bảo cho tốc độ phân hủy ở mức ổn định và đạt hiệu quả cao nhất.
Đôi khi người ta cũng kết hợp cả hai biện pháp để có thể tăng cường sự
phân hủy sinh học. Có nghĩa là vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có
khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời cũng tạo điều kiện tối ưu cho tập
đoàn vi sinh vật bản địa hoạt động. Như vậy, hoạt động của tập đoàn vi sinh
Copyright: Tài liệu đại học ©