ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC
HYDROCACBON THƠM
CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU
TẠI QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. NGHIÊM NGỌC MINH
Thái nguyên - 2008
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lêi c¶m ¬n!
Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS.
Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và
chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công
nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS. Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn
Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của
mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa,
các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Sư
Phạm - Đại Học Thái Nguyên.
1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 8
1.1.1. Tính chất hóa lý 8
1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hƣởng của nó tới môi trƣờng
sống 10
1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH 13
1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam 13
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh 14
1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 15
1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý 16
1.3.2. Phƣơng pháp phân hủy sinh học 16
1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 19
1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH 19
1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV 21
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất
hydrocarbon thơm đa nhân 25
1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật 29
1.6.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống 29
1.6.2. Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử 30
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Nguyên liệu và hóa chất 33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.1.1. Nguyên liệu 33
2.1.2. Hóa chất 33
2.2. Môi trƣờng nuôi cấy 33
2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu 34
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 34
2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nƣớc nhiễm dầu 34
2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số
chủng vi khuẩn 35
2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn 36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
bp
Base pair (cặp bazơ)
USEPA
United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ
môi trường Hoa Kỳ)
LB
Luria-Bertani
PCR
Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
POP
Persistent Organic Pollutant
DNA
Deoxyribonucleic acid
RNA
Ribonucleic acid
rRNA
Ribosomal ribonucleic acid
VSV
Vi sinh vật
X-gal
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
μl
Microlit
μm
Micromet
PAH
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocacbon thơm đa nhân
(PAH) 8
Hình 1.2: Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật 21
Hình 1.3: Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn
và nấm 22
Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30,
BQN31, BQN32, BQN33 43
Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31 45
Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 45
Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 50
Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của
chủng BQN31 50
Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 51
Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng
được lựa chọn 52
Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 53
Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng
vi khuẩn BQN31 53
Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 54
Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen
mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại
diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000
nucleotide so sánh 55
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
Hình 3.12: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol
hoạt động đó cũng đã gây ra những hậu quả không nhỏ về môi trường, đặc
biệt là các hoạt động vận chuyển và khai thác than, chế biến và sử dụng vật
liệu nổ, các hoạt động vận tải, trung chuyển xăng dầu… ở Quảng Ninh.
PAH là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai hay nhiều vòng thơm.
Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước và
các lớp trầm tích) và là một trong các thành phần có trong các sản phẩm của
dầu mỏ [16]. Một số PAH có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và
là chất gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ
(USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành
kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên
cạn [16], [50].
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh,
ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH
4
NO
3
) thì sự có mặt của dầu và một
số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra
đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để. Hiện
nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử
dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng… Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi
chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp.
Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học
đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành
thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi
trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân
1.1.1 Tính chất hóa lý
Các PAH có mặt khắp nơi trong môi trường, những hợp chất này có 2-
6 vòng benzen kết hợp với nhau. Trọng lượng phân tử vào khoảng 128 – 278
g/mol (Hình 1.1). PAH là những chất kỵ nước. Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy
thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước [16], [48]. Đặc
điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng
đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển.
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon
vòng
thơm
Nhiệt độ
nóng chảy
(
o
C)
Nhiệt độ
sôi
(
o
C)
Độ tan
trong
nước
(mg/l)
LogKp
d
Áp suất
hơi ở
20
o
C
(torr)
Phenanthrene
3
101
340
1,29
4
149
360
0,14
5,32
6,8x10
-7
Chrysene
4
255
488
0,02
5,61
6,3x10
-7
Benzo[a]pyrene (BaP)
5
179
496
0,0038
6,04
5,0x10
-7
Dibenzo[a]anthracene
5
262
524
0,0005
5,97
1,0x10
Tính độc của PAH đã được người ta biết đến từ những năm 30 của thế
kỷ XX, khi Hieger và Cook cùng những cộng sự khác nghiên cứu và thấy
tinh thể benzo(a)pyrene màu vàng gây khối u ở động vật thí nghiệm [17]. Với
con người, PAH có thể là tác nhân gây đột biến và dẫn đến ung thư [16],
[31], [11], [27]. Ở quy mô phòng thí nghiệm, một số nghiên cứu đã chỉ ra
rằng, quá trình gây ung thư bởi PAH là một quá trình phức tạp, đa giai đoạn
và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kích thước phân tử PAH, độ phân cực trong
phân tử, hóa học lập thể và các phản ứng xảy ra trong quá trình trao đổi chất,
các nguyên tố mang điện tích mà có ảnh hưởng đến sự gắn kết của các sản
phẩm trao đổi chất với các đại phân tử là DNA, RNA. Một số nghiên cứu
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
khác đã đưa ra kết luận: các PAH có khối lượng phân tử nhỏ, cấu tạo phân tử
chỉ có một, hai, ba vòng thơm là rất độc, trong khi các PAH có khối lượng
phân tử lớn lại có thể gây độc ở mức độ gen, hoặc gây ra đột biến, bởi chúng
có khả năng gắn vào các phân tử DNA, RNA, hoặc protein, gây nên những
biến đổi ở mức phân tử [16], [42].
Naphthalene là một chất ô nhiễm thuộc nhóm PAH gây ảnh hưởng tới
một loạt các cơ quan như phổi, thận và kìm hãm quá trình hô hấp. Nhiễm độc
naphthalene ở người dẫn tới bệnh thiếu máu và viêm thận. Ngoài ra, sự thay
đổi về da và mắt ở những người bị phơi nhiễm naphthalen cũng đã được công
nhận. Phenanthrene được biết như chất cảm quang với da người, chất gây dị
ứng với động vật, đột biến tới hệ thống vi khuẩn trong các điều kiện đặc biệt.
Chất này gây yếu các nhiễm sắc thể tương đồng và kìm hãm sự nối liền các kẽ
hở gian bào. Ngoài ra, các PAH khác như acenaphthalene, fluoranthene,
fluorene đều gây độc cho động và thực vật. Độc tính của benzo(a)pyrene,
benzo(a)anthracene, benzo(b)fluoranthrene, benzo(k)fluoranthrene, dibenzen
(a,h)anthracene và indenol(1,2,3-c,d)pyrene đã được nghiên cứu chứng minh
gây ung thư cho người. Trong tự nhiên hiếm khi bắt gặp các PAH đơn lẻ mà
naphthalene có thể gây chậm phát triển, thậm chí gây chết với động thực vật.
Nghiên cứu ngưỡng độc của naphthalene đối với loài cá vược, người ta đã xác
định LC50 là 240 g/l (LC50 là liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm).
Bằng việc thử nghiệm với một nhóm chuột cho sử dụng anthracene với lượng
1,8 µg/l, người ta thấy rằng, sau 2 tuần gây nhiễm, tỷ lệ chuột xuất hiện khối
u là 40% [31].
Sự tồn tại của các hợp chất PAH trong môi trường vùng bờ biển có thể
đe dọa tới sức khỏe con người và môi trường biển thông qua các tác động trực
tiếp hoặc qua các chuỗi thức ăn trong chu trình vật chất [61].
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
Do tính độc hại như vậy, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã
xếp PAH vào danh sách một trong những chất ô nhiễm điển hình và đã tiến
hành kiểm định sự có mặt của PAH trong hệ sinh thái dưới nước cũng như
trên cạn [16], [53].
1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH
1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam
Các hydrocarbon thơm đa nhân đã được tìm thấy ở nhiều môi trường
sinh thái khác nhau, kể cả môi trường không khí. Trong môi trường nước,
PAH phân bố rộng rãi. Người ta ước tính, hàng năm có khoảng 2,3x10
5
tấn
các hợp chất này đã xâm nhập vào các hệ sinh thái dưới nước. Đặc biệt, với
hệ sinh thái bị ô nhiễm PAH vùng ven bờ biển thường có nguồn gốc từ phế
thải và công nghiệp hóa dầu, công nghiệp khai thác và vận chuyển dầu mỏ,
nước thải công nghiệp và sinh hoạt, cháy rừng và cháy đồng cỏ [61]. Người ta
đã định lượng được nồng độ BaP trong nước uống là 0,0002 đến 0,024 g/l.
Trong 90 mẫu nước kiểm tra ở Mỹ cho thấy nồng độ của 6 PAH từ 0,001 đến
0,01 g/l, 1% mẫu nước kiểm tra cho thấy nồng độ trung bình lớn hơn 0,1
Nếu tính cho cả đất rừng và đất nông nghiệp, lượng ô nhiễm trung bình là
1000 g/kg. Đối với đất bị nhiễm dầu, nồng độ ô nhiễm lớn hơn nhiều so với
vùng đất rừng và đất nông nghiệp, bởi PAH là một thành phần chính có trong
dầu mỏ [55].
Trong đất ở thành thị, nồng độ PAH khoảng 600 – 3000 g/kg, và có
thể cao hơn nữa ở những vùng có các hoạt động vận tải và sản xuất công
nghiệp [55].
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh của PAH, nhưng chúng đều
có bản chất chung là do các quá trình đốt cháy không hoàn toàn các vật liệu
hữu cơ trong tự nhiên hay cho hoạt động sản xuất của con người. Trong tự
nhiên, PAH được phát sinh là từ các quá trình địa chất tự nhiên, hóa lỏng khí
than, các vụ cháy đồng cỏ, cháy rừng thậm chí trong các trận mưa [16], [28],
[31], [38].
Con người cũng có thể gián tiếp hay trực tiếp làm phát sinh PAH vào
môi trường từ việc đốt nhiên liệu (than đá, dầu diesen, ) trong sinh hoạt hay
trong sản xuất (đốt nhiên liệu cho các phương tiện máy móc có động cơ, quá
trình đốt rác tại các nhà lò đốt). Các vụ tràn dầu do sự cố hay trong quá trình
vận chuyển cũng làm phát sinh một lượng đáng kể PAH vào môi trường [31].
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
Tại các nước công nghiệp phát triển, các hoạt động có liên quan đến
đốt cháy tạo ra một lượng lớn PAH. Các PAH này được tích tụ lại trong đất
và làm tăng nồng độ PAH nhanh chóng trong vòng 100 -150 năm trở lại đây
[31].
PAH là nhóm hợp chất độc, nhưng chúng lại khá quan trọng trong công
nghiệp, đặc biệt trong các ngành công nghiệp dược, nhuộm, sản xuất đồ nhựa
và sản xuất thuốc trừ sâu [31]: naphthalene, anthracene, phenanthrene thường
được sử dụng trong công nghiệp sản xuất thuốc nhuộm. Naphthalene cũng
độc hóa học này sẽ là nguồn tiềm tàng gây ô nhiễm cho môi trường.
Công nghệ thiêu đốt cũng đã được sử dụng trên thế giới, phương pháp
xử lý này tương đối triệt để song giá thành lại cao và có khả năng gây ô
nhiễm thứ cấp bởi các sản phẩm phụ tạo trong quá trình vận hành. Các
phương pháp hóa học như declo hóa, oxy hóa, phương pháp vật lý như quang
hóa, sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay áp suất cao cũng mang lại hiệu quả
nhất định. Theo Draper và cộng sự (1987), xử lý bằng phương pháp quang
hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ
20 W/cm
3
ở nhiệt độ 20
o
C trong thời gian 3 ngày [25]. Tuy nhiên, những
phương pháp trên có nhược điểm là không có tác dụng với lớp đất có độ sâu
dưới vài milimet, do đó chỉ xử lý được lớp đất rất mỏng trên bề mặt [49].
Mặc dù làm sạch PAH có thể được tiến hành bằng nhiều biện pháp lý
hóa đã nêu ở trên, nhưng các phương pháp này có nhược điểm là gây ô nhiễm
thứ cấp nên không an toàn và không xử lý triệt để. Mặt khác, giá thành của
việc sử dụng các phương pháp đó l ại cao nên xu hướng sử dụng chúng ngày
càng giảm.
1.3.2. Phương pháp phân hủy sinh học
Hiện nay, phương pháp sinh học đang bắt đầu được quan tâm bởi tính
an toàn và hiệu quả không những về mặt công nghệ mà còn về kinh tế. Chìa
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
khóa của công nghệ phân hủy sinh học là thúc đẩy tập đoàn vi sinh vật bản
địa tham gia vào quá trình phân hủy ở mức cao nhất. Các nghiên cứu cơ bản
đều nhằm mục đích thúc đẩy hiệu quả quá trình tẩy độc thông qua việc kích
thích tập đoàn vi sinh vật trong các điều kiện phân hủy khác nhau tạo ra kết
thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần thiết cho hoạt
động phân hủy của vi sinh vật) [26].
Kích thích sinh học là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao
đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại
thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như độ pH, độ ẩm, nồng độ
O
2
, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v.
Kích thích sinh học hiện là khuynh hướng được sử dụng rộng rãi trong
xử lý ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học [26]. Trong hoạt động
sống, vi sinh vật cần nguyên tố N, P, một số chất dinh dưỡng khác và các điều
kiện sống thích hợp. Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những
chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PAH, nghiên cứu các đặc tính sinh lý,
sinh hóa của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng
dụng cho việc kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa
trong việc phân hủy sinh học PAH tại vùng ô nhiễm. Để tăng cường quá trình
phân hủy sinh học, việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như nguồn cacbon,
nitơ, photpho theo phải theo tỷ lệ nhất định đã đề cập ở phần trên là C:N:P =
100:10:1. Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng cần điều chỉnh thích hợp, đảm
bảo cho tốc độ phân hủy ở mức ổn định và đạt hiệu quả cao nhất.
Đôi khi người ta cũng kết hợp cả hai biện pháp để có thể tăng cường sự
phân hủy sinh học. Có nghĩa là vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có
khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời cũng tạo điều kiện tối ưu cho tập
đoàn vi sinh vật bản địa hoạt động. Như vậy, hoạt động của tập đoàn vi sinh
Copyright: Tài liệu đại học ©