BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
NGUYỄN PHƯƠNG HOA
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIỄN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH
HƯỚNG
ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN
HER2
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
Nguyễn phƣơng Hoa
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIÊN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG
ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2
Ngành: Sinh học
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Lê Quang Huấn
Hà Nội - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………1
Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………… 3
1. Khái niêm, phân loại và ứng dụng của immunotoxin……………………….3
1.2. Tình hình ung thƣ vú (UTV) trên thế giới và ở Việt Nam 4
1.2.1.Trên thế giới 4
2.2.6. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 31
2.2.7. Phƣơng pháp tính sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+ 32
2.2.8. Phƣơng pháp phân tích khối phổ 33
Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Thiết kế vector biểu hiện pET-21A(+)mang gen mã hoá độc tố miễn dịch
hermel 36
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
3.1.1. Cắt gen Hermel 36
3.1.2.Cắt vector pET-21A(+) 36
3.1.3. Gắn gen hermel vào vector pET-21A(+) và chọn dòng plasmid tái
tổ hợp……………………………………………………………………… 38
3.1.4. Xác định trình tự gen hermel.
……………………………………Error! Bookmark not defined.
3.2. Biểu hiện và tối ƣu hoá biểu hiện gen hermel.
………………………….Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-21A(+) vào tế bào E.coli
BL21(DE3) Er
ror! Bookmark not defined.
3.2.2. Biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên
HER2 trong tế bào E. coli BL 21(DE3)……………………………………… 45
3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu
kháng nguyên HER2 trong E. coli 46
3.3.1.Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp độc tố miễn dịch
herme 47
3.3.2 Ảnh hƣởng của oxi lên khả năng biểu hiện của gen mã hoá độc tố
miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2………………………………………48
3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh………………………………………50
3.3.4 khảo sát nhiệt độ nuôi cấy
…………………………………………… Error! Bookmark not defined.
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
Ký hiu
ADN
Amp
bp
ddNTP
dNTP
EDTA
PE
EtBr
HRP
IPTG
IR
Ka
Leucine-rich repeat (đoạn lặp giàu leucine)
Axit lipoteichoic
Nucleic acid sequence-based amplification (khuếch đại dựa trên
trình tự axit nucleic)
Optical Density (Mật độ quang học)
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
Sodium Dodecyl Sulphate
Tris - Acetate - EDTA
Tris - EDTA
ung th- vú
vòng/phút
5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- - D-galactopyranoside
S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi
Nguyờn
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
-1-
MỞ ĐẦU
Cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunotoxin - ITs) được xác định là
những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn lọc quần
thể tế bào mà ở đó có biểu hiện những kháng nguyên hoặc thụ thể bề mặt đặc
hiệu.
Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết và làm tan tế bào
ung thư vú biểu hiện quá mức HER2 một yếu tố phát triển biểu mô biểu hiện
mạnh ở 25-30% bệnh nhân ung thư vú.
ITs được tạo ra bằng việc kết hợp giữa 2 yếu tố : (1) chất gây độc
(toxins) có bản chất là protein và (2) tác nhân hướng đích theo các phương
pháp hoá học (7) hoặc bằng công nghệ ADN tái tổ hợp.
HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô
chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch
immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng
nguyên Her2’’
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
-3-
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Khái niệm, phân loại và ứng dụng Immunotoxin
Như đã nói ở trên, cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunôtxin-IT) được
xác định là những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn
lọc quần thể tế bào mà ở đó biểu hiện những kháng nguyên hoặc receptor bề
mặt đặc hiệu. Những độc tố dạng này đang được nghiên cứu và chế tạo không
chỉ trong trị liệu ung thư (5), mà còn được thử nghiệm trên các bệnh khác
như GvHD (6), các bệnh tự miễn dịch và AIDS (7). Immunotoxin được tạo ra
bằng việc kết hợp giữa hai yếu tố : chất gây độc (toxins) có bản chất là
protein và (2) tác nhân hướng dích theo các phương pháp hoá học (9) hoặc
công nghệ ADN tái tổ hợp (11). Cho tới nay các toxin thường hay được dùng
nhất để chế tạo ITs là các protein từ vi khuẩn [pseudomonas exotoxin (PE)
hay diptheria toxin (DT)] , hoặc từ thực vật [nhóm các protein bất hoạt
riboxom (RIPs) như : Ricin,
pokweet anti- viral protein (PAP). Saporin
(SAP) ]. Cả hai loại toxin này tác động lên tế bào theo cơ chế làm bất hoạt
EP-2 (PE, DT) hay tác động lên điểm gắn của EP-2 (RIPs) trên tiểu phần
riboxom 28S, làm ức chế quá trình sinh tổng hợp protein (17). Mặc dù các
toxin kể trên có hoạt tính cao và chỉ bằng không đến 10 phân tử có thể giết
chết một tế bào đích, việc kết hợp giữa chúng để tạo ra ITs còn mang lại giá
trị sử dụng cao hơn nhiều.Các kết quả nghiên cứu cũng đã cho thấy ITs tạo ra
bởi các toxin kể trên có khả năng ức chế tế bào ung thư mạnh và hiệu quả hơn
từ hàng trăm tới hàng nghìn lần do có tính hướng đích và tính chọn lọc.
Độc tố Melitin là gì ?
lệ số người mắc UTV là 20,3/100.000 người, năm 2000 là 17,4/100.000
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
-5-
người, năm 2006 tỉ lệ tăng lên 40/100.000 người, còn ở thành phố Hồ Chí
Minh là 20/100.000 người [3].
1.3. GIỚI THIỆU VỀ UNG THƢ VÚ
1.3.1. Khái niệm chung về ung thƣ vú
UTV là bệnh ung thư thường gặp ở phụ nữ, bệnh diễn biến chậm,
khoảng 30% số bệnh nhân UTV tiến triển nhanh và dẫn đến tử vong trong
vòng vài tháng. Theo ước tính, từ khi tế bào hình thành khối u đến khi phát
hiện được khối u từ 1 cm thì mất khoảng từ 7 đến 8 năm. Nhưng khối u có
kích thước từ 1 cm đến 2 cm thì mất thời gian trung bình chỉ khoảng 4 tháng.
Đây là thời gian cần có sự chữa trị sớm.
Thường khi về già từ độ tuổi 40 trở đi, các tế bào bất thường dị dạng
(abnormal cells) hay còn gọi là tế bào ung thư phát sinh từ biểu mô ống tuyến
hay biểu mô của tiểu thùy. Nếu không chữa trị sớm, các tế bào ung thư sẽ
phát triển nhanh chóng trong vú, tạo thành một khối u ác tính.
Trong quá trình phát triển, từ khối u đó cho ra những tế bào ung thư đi
vào mạch bạch huyết, lan tới các hạch bạch huyết. Có khi tế bào ung thư đi
theo các mạch máu để xâm nhập các cơ quan nội tạng (gan, phổi, óc ) hay bộ
xương, dẫn đến nhiều biến chứng nguy hiểm chết người.
Người phụ nữ trẻ cũng có thể bị ung thư vú, nhưng xuất độ (tần xuất,
độ xảy đến) thấp hơn nhiều so với người lớn tuổi. Tuổi càng cao càng dễ bị
ung thư đủ loại, trong đó có ung thư vú [4, 28, 29].
1.3.2. Nguyên nhân phát sinh ung thƣ vú
Cho đến nay, con người vẫn chưa biết rõ ràng các nguyên nhân gây ung
thư vú, nhưng có những yếu tố nguy cơ đã được xác định làm tăng khả năng
bị ung thư vú.
a. Tiền sử gia đình
-7-
Thức ăn nhiều mỡ, cũng như rượu có thể làm gia tăng rủi ro mắc bệnh
ung thư vú. National Cancer Institute (Viện Ung Thư Quốc Gia) khuyến
khích phụ nữ nên dùng thức ăn ít mỡ, tập thể dục đều đặn, và chỉ nên dùng
rượu có chừng mực [8, 9, 17].
e. Yếu tố môi trường
Các yếu tố môi trường như thực phẩm, thuốc reserpin, cafein, thuốc xịt
tóc, sự tiếp xúc với tia bức xạ ion hóa từ nguồn tự nhiên hay nhân tạo sẽ làm
tăng nguy cơ phát triển UTV. Gần đây, những nghiên cứu cũng chỉ ra mối
liên quan giữa khói thuốc lá và sự gia tăng nguy cơ mắc UTV. Nhiều nghiên
cứu gần đây cũng cho thấy các hợp chất hữu cơ chứa Clo như PCBs
(polychlorinated biphenyls) cũng làm tăng nguy cơ mắc UTV [6].
1.3.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán
a. Phương pháp vật lý: siêu âm, chụp cộng hưởng từ, chụp hình cắt lớp
phát xạ positron, chiếu xạ hình MIBI, chụp cắt lớp vi tính, nhiệt ký, chiếu
sáng qua mô và chụp thấu quang
b. Phương pháp giải phẫu bệnh lý: Sinh thiết, xét nghiệm giải phẫu
bệnh lý, chẩn đoán lâm sàng (kích thước u, hạch và di căn)
c. Phương pháp hóa sinh và hóa sinh miễn dịch: nguyên lý của
phương pháp dựa trên cơ sở khi cơ thể có khối u, bản thân tế bào ung thư sẽ
phát sinh ra những chất mới đặc hiệu, mà các chất này đóng vai trò như chất
nhận biết cho các tế bào ung thư này. Các chất này thường được gọi tên
“tumor marker” và được phát hiện bằng các phương pháp miễn dịch.
Tumor marker (TM): TM của cơ thể có thể là những phân tử protein,
axit nucleic, enzym, hormon hay một số tế bào đặc biệt trong cơ thể khi xuất
hiện những TBUT. Việc phát hiện những chất này được thực hiện bằng các
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
-8-
cao ung thư vú, người ta đã tìm thấy gen BRCAI. BRCAI nằm trên một locus
nhỏ của nhiễm sắc thể 17 đôi 12 và 21. Phụ nữ bị đột biến trên BRCAI ước
tính nguy cơ ung thư vú là 20% ở tuổi 40, 51% ở tuổi 50 và 81% ở tuổi 70.
- Gen BRCAII (breast cancer gene 2): BRCA2 nằm trên nhiễm sắc thể
13, được phân lập vào năm 1995. Gen này nằm ngay cạnh gen nguyên bào
võng mạc (RBI). BRCAII chiếm khoảng 35% đến 40% ung thư vú mang tính
di truyền và đã tìm thấy trong những gia đình bị ung thư vú, gặp cả ở nam và
nữ.
- Gen BRCAIII (breast cancer gene 3): Trong số những gia đình có
nguy cơ cao bị ung thư vú, có khoảng 10.20% không thấy có mối liên quan
hoặc BRCAI hoặc BRCAII. Giả thuyết có thể có một gen BRCAIII liên quan
đến ung thư vú. Phân tích mối liên quan trong 8 gia đình đã cung cấp một số
dữ liệu bước đầu cho thấy có một gen thứ 3 liên quan đến ung thư vú.
Ngoài ra, gần đây các nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu đến đột
biến gen ti thể có liên quan tới chẩn đoán UTV.
1.3.4. Các phƣơng pháp điều trị
a) Hóa chất trị liệu: là phương pháp dùng hóa chất để tiêu diệt tế bào
ung thư vú như: adriamycin, cytoxan, taxol, taxotere, navelbine Mỗi loại lại
có cơ chế tác động riêng nhằm ngăn cản sự sinh sôi không kiểm soát của tế
bào. Ví dụ: adriamycin có tác dụng gắn vào chuỗi ADN làm cho tế bào không
thể phân chia được trong khi taxol và taxotere thì gây độc tế bào ung thư bằng
cách ức chế sự phân chia của tubulin.
b) Hormon trị liệu: đây là phương pháp điều trị ung thư bằng cách
ngăn cản hay cho thêm kích thích tố vào cơ thể. Rất nhiều trường hợp UTV
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
- 10 -
phát triển dưới sự kích thích của các kích thích tố. Nếu chế ngự được sự kích
thích này, các tế bào ung thư có thể ngừng phát triển hay bị tiêu diệt. Các biệt
dược thông thường được dùng trong nhóm này gồm tamoxifen, toremifene,
eerG bởi hai nhóm nghiên cứu độc lập vào năm 1985 (Coussens et al., 1985;
Semba et al., 1985). Tuy nhiên, các nghiên cứu sau đó cho thấy hai gen này
hoàn toàn giống nhau và thống nhất đặt tên gọi HER-2/neu (HER2). HER2
thuộc họ gen mã hóa các thụ thể sinh trưởng của các tế bào biểu bì HER
(Human Epidermal Growth Factor Receptor). Nó còn có các tên gọi khác như
v-erb-b2, Neu, TKR1, NGL, HER2, nằm ở nhiễm sắc thể số 17, gần với tâm
động, ở vị trí q11.2 - q12.0. HER2 là một gen tiền ung thư (proto-oncogen) có
chiều dài 30528 bp chứa 27 exon, tổng chiều dài các exon là 4477 bp trong đó
exon dài nhất có 969 bp, exon ngắn nhất có chiều dài 48 bp, gen này có 3 bản
sao tương đồng tương ứng với 3 allele B1( Ile-654/Ile655); allele B2 (Ile-
654/Val-655); allele B3 (Val-654/Val-655).
Mặc dù kích thước gen HER2 trong hệ gen là rất lớn nhưng quá trình
hiệu chỉnh sau khi phiên mã tạo ra mARN trưởng thành với khoảng 1800 bp
[1, 5, 18, 20, 22].
1.4.2.2. Cấu trúc protein HER2
Protein HER2 có khối lượng phân tử 185 kDa, gồm 3 phần chính:
+ Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu N của thụ thể.
Nằm ở vùng ngoại bào này là một vùng lớn có khả năng gắn kết với các yếu
tố tăng trưởng biểu mô.
+ Vùng xuyên màng lipit.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
- 12 -
+ Vùng nội bào có chứa đuôi C có mang các gốc tyrosine được
phosphoryl hóa chịu trách nhiệm cho hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể.
Hình 1.1. Cấu trúc của protein HER2 [74]
Cấu trúc của HER2/neu: (1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất
cảm ứng LD1, LD2 (Ligand binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và
CR2); (3): Một vùng xuyên màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt
tính tyrosine kinase (TK); (5): Một đuôi Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal)
hiệu khởi đầu cho các con đường sinh ung thư khác nhau. Dưới đây là một đề
xuất của Moaser về con đường sinh ung thư do sự biểu hiện quá mức của
HER2.
Hình 1.3. Sự bất bình thường trong việc truyền tín hiệu do sự biểu hiện quá mức
của HER2
Sự biểu hiện quá mức của HER2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa.
Tăng dimer HER2-EGFR dẫn tới sự tăng sinh và sự xâm lấn của tế bào. Sự tăng
dimer hóa đồng hình HER2 làm mất tính phân cực của tế bào. Sự tăng dimer
HER2-HER3 có ảnh hưởng tới sự tăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức
năng trao đổi chất của tế bào. Tăng sự biểu hiện quá mức của HER2 dẫn tới tăng
cường độ truyền tín hiệu. Một vài yếu tố phiên mã được cảm ứng trong những tế
bào có sự biểu hiện quá mức HER2 là kết quả của những sự thay đổi biểu hiện gen
ở mức dư thừa .
Feldman và cs (2007) đã đưa ra mô hình về con đường truyền tín hiệu
của những thụ thể hoạt động này. Ở trạng thái hoạt động nó kích thích con
đường truyền tín hiệu phosphatidyl inositol 3′-kinase (PI3K) thông qua việc
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
- 15 -
gắn tiểu phần p85 vào Akt, dẫn tới hoạt hóa Akt. Akt làm bất hoạt các phân tử
tiền apoptosis bao gồm Bad, caspase-9 và p53. Thêm vào đó, dưới tác động
của Akt, các hoạt động chuyển hóa glucose, các kênh vận chuyển glucose
(GLUT) (nhờ sự phosphoryl GSK3) và sự tổng hợp protein, chu trình phát
triển của tế bào (thông qua sự phosphoryl hóa của protein p90RSK, p70S6K,
mTOR) đều tăng lên là những nhân tố ngăn chặn quá trình apoptosis. Hơn thế
nữa, sự hoạt hóa các yếu tố phiên mã κB (nuclear factor κB) còn kích ứng sự
biểu hiện của các gen anti-apoptosis thông qua các protein c-IAP1-2, TRAP
1-2, và A1/Bfl-1. Kết quả của sự tăng sinh này cũng là một trong những
nguyên nhân dẫn tới quá trình hình thành ung thư [13, 15].
Hình 1.4. Cơ chế gây ung thư của HER2
dạng của kháng thể [2].
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
- 17 -
Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo của kháng thể
1.5.2. Kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng là kháng thể được tạo ra từ một dòng tương bào
biệt hóa từ lympho B ban đầu sau khi được kích thích bởi một quyết định
kháng nguyên. Kháng thể đơn dòng do quyết định kháng nguyên nào kích
thích thì chỉ kết hợp đặc hiệu với quyết định kháng nguyên ấy mà thôi.
1.5.3. Kháng thể đơn chuỗi – Mảnh kháng thể
Trong cấu tạo của bất kỳ một kháng thể tự nhiên nào đều có 4 vùng biến
đổi (V - Variable). Sự kết hợp giữa 1 vùng biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và
1 vùng biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí nhận diện kháng nguyên
(paratope). Như vậy, mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên.
Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một kháng thể có thể gắn được với
2 kháng nguyên giống nhau. Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là
phần nhận biết kháng nguyên, F: fragment, ab: antigen binding). Vùng kháng
nguyên gắn vào kháng thể gọi là epitope.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
Copyright: Tài liệu đại học ©