BỘ CÔNG THƢƠNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN
ĐỀ TÀI:
PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN
B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG

Giảng viên hƣớng dẫn : THS. NGUYỄN THANH NAM
Lớp : 01DHTP1
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Khóa học : 2010-2014
Năm học : 2012-2013

TP. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2012

BỘ CÔNG THƢƠNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN
ĐỀ TÀI:
PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN

2.2. Các phương pháp xác định aflatoxin B1 5
2.3. Tổng quan phương pháp sắc ký bản mỏng 6
2.3.1. Chuẩn bị sắc ký 7
2.3.2. Kỹ thuật 7
2.3.3. Phân tích 8
2.4. Áp dụng phân tích aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng 9
2.4.1. Nguyên liệu 9
2.4.2. Thiết bị và hóa chất 9
2.4.3. Tiến trình 9
2.4.4. Kết quả và bàn luận 10
2.4.4.1. Tỷ lệ và mức độ nhiễm Aflatoxin B
1
trên các mẫu phân tích 10
2.4.4.2. So sánh tỉ lệ phát hiện của cột IAC và cột Silicagel 11
2.4.5. Kết luận và khuyến nghị 12
TÀI LIỆU THAM KHẢO 14

LỜI MỞ ĐẦU
Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, ý thức về vệ sinh an toàn thực phẩm của
người tiêu dùng đã được nâng cao đáng kể thông qua các phương tiện truyền thông,
sách báo, báo đài,…Do đó, ý thức về thói quen sử dụng thực phẩm sạch và an toàn
đang ngày càng được quan tâm và chú trọng hơn. Các bằng chứng rõ ràng là hiện nay
các nhà hàng, dịch vụ ăn uống, siêu thị đang ngày càng trở nên gần gũi và quen thuộc
với người tiêu dùng. Bên cạnh đó, cũng còn những cơ sở sản xuất thực phẩm nhỏ, lẻ,
quán ăn lề đường,…vẫn còn nhiều bất cập và vấn đề an toàn thực phẩm vẫn chưa được
quan tâm đúng cách. Cùng với sự lo lắng đó, hiện nay “Phân tích thực phẩm” hiện nay
là một công cụ rất hữu dụng, giúp chúng ta phân tích, đánh giá được các mối nguy
cũng như các nguy cơ tiềm ẩn trong thực phẩm được phát hiện và ngăn chặn kịp thời.
Trong tương lai không xa, ngành “Phân tích thực phẩm” sẽ trở thành một phần không
thể thiếu, giúp con người tự tin hơn khi dùng thực phẩm và mang lại cảm giác an toàn
ĐẶT VẤN ĐỀ
Lương thực, thực phẩm, đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô,
khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người. Vì thế việc
nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là một vấn đề được các tổ chức quốc tế
cũng như các cơ quan khoa học về lương thực thực phẩm của thế giới đặc biệt quan
tâm. Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kĩ thuật bảo quản gìn giữ các giá
trị dinh dưỡng của chúng, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên các nông sản đó đồng
thời chế biến chúng thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.
Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, là điều kiện thuận lợi cho nấm
mốc phát triển. Do các hoạt động hết sức mạnh mẽ của các vi sinh vật có hại đã gây ra
tổn thất lớn cho nông sản ở giai đoạn sau thu hoạch, trong đó tổn thất gây nên do nấm
mốc chiếm một phần đáng kể. Ngoài việc gây tổn thất về lượng cho nông sản nấm mốc
còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khoẻ con người và động vật kinh tế.
Nấm mốc phát triển trên lương thực không những sử dụng các chất dinh dưỡng của
hạt: Protein, glucid, lipit và các vitamin, chúng còn tiết ra các độc tố. Độc tố aflatoxin
do Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus moninus tạo ra là độc tố
nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây
tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến,
…thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong.
Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm
trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và
các động vật kinh tế. Do vậy, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm
nấm mốc và các độc tố mốc, các biện pháp phòng trừ độc tố mốc trên lương thực, thực
phẩm. Giới hạn về mức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn
vệ sinh thực phẩm.
Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 1


Hàm lƣợng AF
trung bình (ppb)
Bắp hạt
25
205
Gạo và tấm gạo
2
22
Đậu nành hạt
1
50
Cám gạo
3
29
Khô dầu mè
3
8
Khô dầu dừa
7
17
Khô dầu đậu nành
4
12
Khô dầu đậu phộng
29
1200
Bột khoai mì lát
1
40
Thức ăn hỗn hợp

đối với bột hạt bông dùng cho bò, lợn và gia cầm

Bảng 1.3. Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam
ML (microgam/kg)
Tiêu chí
5
Đối với Aflatoxin B
1
trong thực phẩm nói chung
15
Đối với Aflatoxin B
1
, B
2
, G
1
, G
2
trong thực phẩm nói chung
Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 4

0,5
Đối với Aflatoxin M
1
trong sữa và các sản phẩm sữa

1.3. Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng
Có ít nhất 13 dạng aflatoxin khác nhau có trong tự nhiên. Aflatoxin B
1

1
: chất chuyển hóa của aflatoxin B
1
trên người và động vật
 Aflatoxin M
2
: chất chuyển hóa của aflatoxin B
2
trong sữa của bò được cho ăn
thức ăn nhiễm aflatoxin
 Aflatoxicol
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 5

CHƢƠNG 2. PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN B1 TRONG BẮP
VÀ ĐẬU PHỘNG
2.1. Đặt vấn đề
Thức ăn gia súc, thực phẩm và các loại hạt có dầu, thảo dược,…đều có khả năng
nhiễm độc tố nguy hiểm aflatoxin B
1
do 2 loài vi nấm điển hình là Aspergillus flavus
và Aspergillus paraciticus gây nên. Các aflatoxin là những tinh thể màu vàng tan trong
một số dung môi hữu cơ (clorofoc, methanol, acetone,…) và độc tính cao, rất bền vững
với tác nhân hóa lí , chỉ bị huỷ ở nhiệt độ trên 120
0
C trong môi trường kiềm.
Do cấu trúng hóa học có vòng dihydrofuran (hình 2) nên aflatoxin B
1
liên kết
với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong. Ngoài ra, aflatoxin B1 còn

Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc
kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm
pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide,
hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần
phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí
bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần
trong dung dịch.
Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:
 Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa
 Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật
 Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 7

 Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn
 Giám sát các phản ứng hữu cơ
Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài
bước, làm tăng độ dung giải của sắc kí lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn. Phương
pháp này được gọi là sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC -
HPTLC).
2.3.1. Chuẩn bị sắc ký
Bản sắc kí được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một lượng
nhỏ chất trơ để kết dính, như calcium sulfate (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được
trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa.
Bản sắc kí này sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30
phút ở nhiệt độ 110 °C. Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học
phân tích, và khoảng 1-2mm cho sắc kí lớp mỏng dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc kí đều
bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh.
2.3.2. Kỹ thuật
Phương pháp tiến hành giống với sắc kí giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn

dụng, như là C18-chức năng hóa silicagel.
Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính
phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu
thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt
khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu,
dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một
phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.
2.3.3. Phân tích
Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương
pháp được sử dụng để quan sát những vệt này:
 Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-
activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát được
những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV
254
). Lớp hấp phụ vì thế sẽ tự
phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này.
 Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau.
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 9

 Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc kí vào, hoặc
phun lên bản sắc kí.
 Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một
màng polyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn,
chẳng hạn như khối phổ.
Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu R
f
của mỗi vệt mẫu sẽ được xác
định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di
chuyển được của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được

Phân tích thực phẩm Trang 10

Cột IAC Kết quả IAC
Bắp hạt+đậu phộng Sắc ký bản mỏng TLC
Cột silicagel Kết quả silicagel
Sơ đồ phân tích hàm lƣợng Aflatoxin B
1
bằng cột IAC:
Mẫu phân tích (25gam)

chiết xuất (5g NaCl, 37,5ml nước cất, methanol
87,5ml, thời gian 30 phút)

lọc thường (thu 15 ml và cho thêm 15ml nước cất)

lọc giấy thủy tinh (thu 45ml dịch lọc)

qua cột IAC (2 giọt/phút)

làm
khô dịch chiết (trong N
2
/40 – 50
0
C)

định lượng bằng TLC.
Sơ đồ phân tích hàm lƣợng Aflatoxin B
1
bằng cột Silicagel:

SO
4
.
 Tiến hành
Mẫu phân tích (50gam)

chiết xuất (25ml nước cất, 250ml CHCl
3
, đậy kín
và lắc mạnh trong 30 phút)

lọc thường (thu 50 ml)

cột silicagel (đã chuẩn
bị)

rửa giải tạp (lần 1: 150ml C
6
H
6
, lần 2: 150ml (C
2
H
5
)
2
O)

rửa giải
Aflatoxin B

2.4.4. Kết quả và bàn luận
2.4.4.1. Tỷ lệ và mức độ nhiễm Aflatoxin B
1
trên các mẫu phân tích Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 11

Bảng 2.1. Hàm lƣợng Aflatoxin B
1
trong các mẫu ở chợ Bà Chiểu và Tân Sơn
Nhất
STT
Tên mẫu
Cột IAC
Cột Silicagel
Hàm lƣợng Aflatoxin B
1
(ppb)
1
Bắp
không phát hiện
không phát hiện
2
Bắp
7
5
3
Bắp


Nhận xét: theo bảng 3.2, mức độ nhiễm các mẫu đều ≤ 20ppb và cột IAC
phát hiện được 7 mẫu/10 mẫu và cột silicagel phát hiện được 3 mẫu/10 mẫu. Nhìn
chung, mức độ nhiễm trên bắp và đậu phộng ≤ 10ppb. Như vậy, độ nhạy của cột
IAC cao hơn so với cột silicagel.
2.4.4.2. So sánh tỉ lệ phát hiện của cột IAC và cột Silicagel Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 12

Bảng 2.2. So sánh tỉ lệ phát hiện Aflatoxin B
1
của cột IAC và Silicagel
Mẫu
Tổng số
mẫu
Cột IAC
Cột Silicagel
Số mẫu nhiễm
Tỉ lệ nhiễm
(%)
Số mẫu
nhiễm
Tỉ lệ
nhiễm (%)
Khách hàng
16
3
18,75

1
của cột IAC cao hơn so với cột Silicagel.
Trong 30 mẫu, cột IAC phát hiện 14 mẫu (chiếm 46,67%) và cột silicagel phát hiện
được 9 mẫu (chiếm 30%).
Cột silicagel không phát hiện được mẫu nhiễm Aflatoxin B
1
dưới hàm
lượng 2ppb.
Khuyến nghị:
Với phương pháp đơn giản, ít tốn kém và phổ phát hiện nhạy và rộng nên
phương pháp dùng cột IAC để phát hiện Aflatoxin B
1
trong các sản phẩm và
nguyên liệu có dầu là phương pháp tối ưu hiện nay. Hi vọng phương pháp này sớm
được áp dụng rộng đặc biệt tại các chợ, các nguồn thu mua nguyên liệu.
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 13

Phương pháp này chỉ thử nghiệm một số mẫu giới hạn, đề tài này cần được
nghiêu cứu thêm các nội dung sau:
 Khảo sát thêm một số mẫu thuộc các nguồn nguyên liệu khác nhau
 Khảo sát thêm một số khu vực khác nhau
 Khảo sát thêm một số mẫu trong các thời điểm khác nhau.
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt (tham khảo chỉnh)
[1]. Huỳnh Minh Duy, Nguyễn Văn Phú, Xác định hàm lượng độc tố
Aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng bằng phương pháp sắc ký bản