Download Đề tài So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III miễn phí
2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
2.2.2.1./Tính chính xác:
Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song.
Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.1.1
Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả (RSD = 0,37% < 2%). Như vậy phương pháp là chính xác
2.2.2.2 Tính tuyến tính:
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ trên chất chuẩn Berberin.
Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid có khối lượng từ 0,1600g→ 0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định lượng)
Cách tiến hành tương tự 2.2.1
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hay đưa ra máy in. [8]
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ. [8], [11]
1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký:
Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ( hình 1):
Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng
Trong đó :
to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách
tR (thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích.
tR’ (thời gian lưu thực ) = tR- to.
W0,5: Độ rộng pic ở nửa chiều cao
Wb: Độ rộng đáy pic.
1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’
[8] Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau.
1.3.2.2 Độ chọn lọc a (selectivity - factor)
a= (k2' > k1' ) [4], [8]
a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2.
1.3.2.3. Độ phân giải (resolution)
Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức:
[4], [8]
Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5
1.3.2.4. Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức:
[4], [8]
Trong đó:
W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lượng được chấp nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tượng kéo đuôi càng rõ. Hiện tượng đỉnh kéo đuôi (tailing peak) có thể là do tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh hay cột sắc ký bẩn. Đỉnh kéo tuyến trước (fronting peak) có thể do lượng mẫu đưa vào quá lớn so với năng lực cột [7].
1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N
Đặc trưng cho hiệu lực cột.
N = 16 hay N=5,54 [4], [8]
Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng công thức:
1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8]
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau:
a/Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar)
a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hay thép không gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 mm ) và đuổi khí hòa tan.
c/ Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tích vào cột.
Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.
Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp qua màng lọc 0,45 mm, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi thích hợp.
d/ Cột sắc ký lỏng HPLC
Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được với áp suất cao đến vài trăm bar.
- Chiều dài cột: 10, 15, hay 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh có đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 mm).
- Đường kính cột: 4 hay 4,6 mm.
e/ Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ UV - VIS. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa.
f/ Thiết bị hiển thị kết quả
Có nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu đo dưới dạng pic.
Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 2
Bơm
Van tiêm mẫu
Binh chứa pha động
Cột
Bộ phận tự ghi
Detector
Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC
1.3.5. Cách đánh giá pic[7]
* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hay máy phân tích cơ học (sai số 1,3 %). Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao.
* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phương pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số k' là hằng định.
* Với pic có đường nền bị nhiễu hay bị hẹp thì việc xác định chiều cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.
1.4.Tổng quan PHƯƠNG PHáP QUANG PHổ HấP THụ UV-VIS
1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6]
1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ Io qua dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì đi qua dung dịch .
Mối quan hệ giữa I và Io được thể hiện bằng định luật Lambert-Beer.
I = Io 10 -εCl
Với ε là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch.
1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer
+ Chùm tia sáng phải đơn sắc
+ Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)
+ Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang).
+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánh sáng (UV-VIS).
1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer
+ Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) như do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém.
+ Sai lệch do hoá học:
- Do sự phân ly (ion hoá): thường gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử chất tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly không như nhau.
- Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng đơn phân tử.
+ Do phản ứng các chất lạ:
- Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng có thành phần như dung dịch, chỉ thiếu chất cần định lượng.
- Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hưởng tới kết quả định lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng tạo màu, phải chú ý tới điều kiện phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng.
1.4.1.4. Một số đại lượng thông dụng...
G704a7zqbOFCE2h
