Download miễn phí Khóa luận Nhân giống lan hồ điệp Phalaenopsis sp. bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS – temporary immersion system)
MỤC LỤC
Nội dung Trang
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH x
DANH MỤC ĐỒ THỊ xii
LỜI MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục đích nghiên cứu 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu 3
5. Phương pháp nghiên cứu 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 5
1.1.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro
5
1.1.2. Các bước nhân giống in vitro 6
1.1.3. Các kỹ thuật nuôi cấy in vitro 6
1.1.3.1. Nuôi cấy nốt đơn thân 6
1.1.3.2. Nuôi cấy chồi bên 6
1.1.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 6
1.1.3.4. Nuôi cấy mô sẹo 7
1.1.3.5. Nuôi cấy huyền phù tế bào 7
1.1.3.6. Nuôi cấy thể đơn bội 7
1.1.3.7. Nuôi cấy protoplast (tế bào trần) 8
1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro 8
1.1.4.1. Ưu điểm 8
1.1.4.2. Nhược điểm 9
1.2. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới và ở Việt Nam 9
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới 9
1.2.2. Tình hình sản xuất hoa Lan ở Việt Nam 11
1.3. Giới thiệu về Lan Hồ Điệp 12
1.3.1. Nguồn gốc và phân bố 12
1.3.2. Phân loại khoa học 15
1.3.3. Đặc điểm hình thái 16
1.3.3.1. Cơ quan sinh dưỡng 18
1.3.3.2. Cơ quan sinh sản 18
1.3.4. Điều kiện sinh thái của Lan Hồ Điệp 20
1.3.4.1. Nhiệt độ 20
1.3.4.2. Độ ẩm 20
1.3.4.3. Ánh sáng 20
1.3.4.4. Độ thông thoáng 21
1.3.4.5. Nhu cầu nước tưới 21
1.3.4.6. Dinh dưỡng 22
1.3.4.7. Một số sâu bệnh và cách phòng trị 22
1.3.4.8. Chậu, giá thể và cách trồng 24
1.3.5. Giá trị kinh tế và tình hình sản xuất Lan Hồ Điệp 24
1.3.5.1. Giá trị kinh tế của Lan Hồ Điệp 24
1.3.5.2. Tình hình sản xuất Lan Hồ Điệp 26
1.3.6. Các phương pháp nhân giống Lan Hồ Điệp 28
1.3.6.1. Phương pháp nhân giống truyền thống 28
1.3.6.2. Phương pháp nhân giống hiện đại 30
1.4. Giới thiệu hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS 32
1.4.1. Giới thiệu 32
1.4.2. Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống 33
1.4.3. Phân loại hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 34
1.4.3.1. Hệ thống thùng nghiêng và hệ thống Rocker 35
1.4.3.2. Hệ thống ngập hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng 35
1.4.3.3. Hệ thống ngập một phần và cơ chế thay mới môi trường
dinh dưỡng 36
1.4.3.4. Hệ thống ngập hoàn toàn có sự vận chuyển môi trường lỏng bằng áp lực không khí và không có sự thay mới môi trường 37
1.4.4. Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 38
1.4.4.1. Hệ thống RITA® 38
1.4.4.2. Hệ thống bình sinh đôi BIT® 39
1.4.4.3. Hệ thống Plantima® 40
1.4.5. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống trên thế giới và ở Việt Nam 42
1.4.5.1. Thành tựu trên thế giới 42
1.4.5.2. Thành tựu ở Việt Nam 46
1.4.6. Ưu và nhược điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
47
1.4.6.1. Ưu điểm 47
1.4.6.2. Nhược điểm 48
1.5. Môi trường nuôi cấy in vitro 49
1.5.1. Vai trò của các thành phần trong môi trường nuôi cấy 49
1.5.2. Một số môi trường thường được dùng trong nuôi cấy in vitro
49
1.5.3. Thành phần các chất khoáng vô cơ 50
1.5.3.1. Khoáng đa lượng 50
1.5.3.2. Khoáng vi lượng 52
1.5.4. Carbon và nguồn năng lượng 54
1.5.5. Vitamin 55
1.5.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 55
1.5.7. Một số yếu tố khác trong môi trường nuôi cấy mô Lan 55
1.5.7.1. Các chất hấp phụ phenol 55
1.5.7.2. Nước dừa và các dịch chiết khác 56
1.5.7.3. Yếu tố làm đặc môi trường 57
1.5.7.4. Ảnh hưởng của pH 58
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 59
2.1. Địa điểm thí nghiệm 59
2.2. Vật liệu nghiên cứu 59
2.2.1. Vật liệu 59
2.2.2. Môi trường nuôi cấy 61
2.2.3. Điều kiện thí nghiệm 61
2.3. Phương pháp nghiên cứu 61
2.3.1. Cách pha môi trường 61
2.3.1.1. Cách pha dung dịch mẹ 61
2.3.1.2. Cách pha môi trường cấy 62
2.3.2. Hấp khử trùng 62
2.3.2.1. Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy 62
2.3.2.2. Hấp khử trùng công cụ nuôi cấy 62
2.3.3. Các thao tác trong phòng cấy 63
2.3.4. Cách bố trí thí nghiệm 64
2.3.4.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích
hợp để vi nhân giống 64
2.3.4.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan 67
2.3.4.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan 68
2.4. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu 69
2.5. Chuyển cây con ra vườn ươm 69
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70
3.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống 70
3.1.1. Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân nhanh PLB 70
3.1.1.1. Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá 70
3.1.1.2. Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu để nhân nhanh PLB 74
3.1.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB
79
3.1.2. Thí nghiệm 1.2: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB. 83
3.1.3. Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của chồi Lan Hồ Điệp 87
3.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan 89
3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan 93
3.3.1. Thí nghiệm 3.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima 93
3.3.2. Thí nghiệm 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập lên quá trình nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima 101
3.4. Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây Hồ Điệp ngoài vườn ươm 106
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 109
4.1. Kết luận 109
4.1.1. Thiết lập môi trường vi nhân giống 109
4.1.2. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan Hồ Điệp lai Dtps. Taida Salu cho phép đưa ra các kết luận sau 109
4.2. Đề nghị 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO 111
PHỤ LỤC 118
http://s1.liketly.com/flash/edoc/-images-nopreview.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52594/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
hu kỳ (hình 1.8b). Mẫu cấy được đặt trên một tấm lưới polypropylene gắn vào thành bình nuôi cấy. Quá trình điều khiển thực hiện ở việc nạp môi trường, độ sâu mực chất lỏng, chu kỳ tuần hoàn môi trường lỏng và được điều chỉnh theo lịch trình trong suốt quá trình nuôi cấy. Hệ thống có khả năng điều khiển đồng thời 4 bình nuôi cấy.
a
b
Hình 1.8a. Hệ thống của Aitken - Christie và Davies (1988).
Hình 1.8b. Hệ thống của Simonton và cộng sự (1991).
1.4.3.4. Hệ thống ngập hoàn toàn có sự vận chuyển môi trường lỏng bằng áp lực không khí và không có sự thay mới môi trường
Nhiều hệ thống khác nhau đã được Alvard và cộng sự (1993) mô tả trong đó có những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời được thiết kế gần đây nhất, tất cả đều khá đơn giản và rất dễ sử dụng. Hệ thống này cho phép toàn bộ mẫu cấy được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, đồng thời bầu không khí trong bình nuôi được làm mới nhờ sử dụng bộ phận bơm khí có chức năng vừa cung cấp không khí vào môi trường, vừa đẩy chất lỏng ra vào bình nuôi cấy. Mẫu cấy được đặt trong bình nuôi thành một khối, điều này giúp chúng ta tiết kiệm được thời gian đặt mẫu trên giá đỡ.
Môi trường lỏng được đẩy từ bình chứa môi trường sang bình nuôi cấy và ngược lại nhờ một áp lực khí bơm vào bình chứa chất lỏng. Để tránh sử dụng nhiều ống nối, bình chứa thường thiết kế gồm hai bình có cùng thể tích. Áp suất vượt mức được đưa qua những van solenoid hay một máy nén khí nối với công tắt đã được lập trình. Điều này cho phép chúng ta xác định được thời gian và thời điểm ngập nước vào ngăn chứa cây.
Do những hệ thống này không có bình chứa môi trường mới nên môi trường nuôi cấy phải được thay mới sau 4 - 6 tuần. Tuy nhiên việc thay đổi này rất nhanh và không cần thiết phải di chuyển mẫu cấy. Các biến thể khác nhau của hệ thống này đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đó là hệ thống RITA® (the Recipient for Automated Temporary Immersion system), hệ thống đôi (BIT®) và hệ thống Plantima.
Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
1.4.4.1. Hệ thống RITA®
Hệ thống RITA® (hình 1.9) (Teisson và Alvard, 1995) gồm một bình chứa dung tích 1 lít có hai ngăn, ngăn trên chứa mẫu cấy và ngăn dưới chứa môi trường. Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng ở dạng ngăn dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy. Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì. Trong thời gian mẫu ngập trong môi trường lỏng, không khí được sục vào trong môi trường lỏng dưới dạng những bọt khí góp phần làm xoay trở nhẹ mẫu cấy và làm mới không gian bên trong bình nuôi cấy, áp suất vượt mức sẽ đẩy không khí trong bình ra ngoài qua một màng lọc khí trên nắp bình.
Hình 1.9. Hệ thống RITA®
Bao gồm:
Pha 1: mô không ngập trong môi trường.
Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy.
Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA®.
Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới.
1.4.4.2. Hệ thống bình sinh đôi BIT®
Hệ thống bình đôi BIT® (hình 1.10) do Escalona và cộng sự (1998) được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma; thiết kế chủ yếu phục vụ cho việc nhân sinh khối cơ quan do có thể tích bình chứa lớn hơn và có giá thành thấp hơn. Cách dễ dàng nhất để vận hành hệ thống nuôi cấy ngập chìm sử dụng áp lực khí là nối hai bình thủy tinh hay plastic có dung tích từ 250 ml - 1000 ml bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại. Hệ thống BIT® được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên.
Hình 1.10. Hệ thống bình đôi BIT®
1.4.4.3. Hệ thống Plantima®
Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA® tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc. Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A - tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan. Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản (Hình 1.11, Hình 1.12)
Hình 1.11. Các thành phần của bình Plantima, Đài Loan.
ĐaiLoan
Hình 1.12. Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập
Hình 1.13. Hệ thống Plantima
a: Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập
b: Cây sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima.
Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống trên thế giới và ở Việt Nam
Sử dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong thương mại, điều quan trọng là phải hiểu rõ các đặc điểm về sinh trưởng, quá trình nuôi cấy và chất lượng của mẫu cấy; so sánh giữa chúng với những mẫu được nuôi cấy trong hệ thống thông thường.
1.4.5.1. Thành tựu trên thế giới
Hệ thống ngập chìm tạm thời TIS là một trong những phương pháp vi nhân giống đầy triển vọng trong sản xuất cây giống thương mại.
+ Trong sự nhân nhanh chồi và các đoạn cắt in vitro
Sự ngập chìm tạm thời kích thích sự nảy chồi. Hệ thống này cho phép sự sinh trưởng liên tục của chồi mà không cần cấy chuyền mẫu cấy. Chồi thu được khi nuôi cấy ngập chìm tạm thời một phần cao hơn và có chất lượng tốt hơn so với những chồi thu được trên môi trường bán rắn.
Một chứng minh đầy đủ và thuyết phục về tính hiệu quả của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong việc gia tăng số lượng chồi khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chuối (Musa, phụ nhóm AAH). Đồng thời Alvard và cộng sự (1993) chứng minh rằng sử dụng môi trường lỏng tác động mạnh mẽ vào sự phát triển và gia tăng sự tỷ lệ tạo chồi trong vi nhân Chuối.
- Chồi Chuối trong môi trường nuôi cấy lỏng đơn giản hay trên giá thể bằng cellulose có sự nhân chồi bình thường hay không có gì khác biệt.
- Chồi trên môi trường bán rắn có sự ngập một phần và trong môi trường lỏng có sục khí có hệ số nhân chồi từ 2,2 - 3,1.
- Hệ số nhân chồi cao nhất (>5) thu được trên mẫu nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy ngập chìm tạm thời.
Các tác giả này đã thu được kết quả trên khi sử dụng hệ thống RITA® với thời gian ngập là 20 phút cứ mỗi 2 giờ. Một nhóm nhà nghiên cứu Cuba đã thu được kết quả tương tự trên đối tượng cây Chuối Musa acuminata khi sử dụng hệ thống bình đôi (Teisson và cộng sự, 1999).
Tương tự như vậy, Escalona và cộng sự (1999) đã sử dụng hệ thống trên để nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus, kết quả cũng cho thấy nuôi cấy ngập chìm tạm thời giúp gia tăng hệ số nhân cùng với trọng lượng tươi và trọng lượng khô sau 42 ngày nuôi cấy. Hệ số nhân được gia tăng khoảng 300% so với nuôi cấy lỏng và 400% so với nuôi cấy trên môi trường rắn. Có gần 5000 cây Dứa thu được từ một hệ thống như vậy.
Đối với cây Cà Phê (Coffea arabica và C. canephora), nhân giống bằng các in vitro trên môi trường rắn rất hạn chế do sự sinh trưởng chậm của chồi. Hệ số nhân xấp xỉ 6 - 7 lần trong 3 tháng (Sondhal và cộng sự, 1989). Khi sử dụng hệ thống RIT...
