Download miễn phí Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD
MỤC LỤC
CHưƠNG TRANG
LỜI CẢM TẠ . iii
TÓM TẮT . iv
SUMMARY . v
MỤC LỤC . vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT . ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH . x
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ . xi
Chương 1 MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài . 2
1.2.1. Mục đích . 2
1.2.2. Yêu cầu . 2
1.2.3. Giới hạn đề tài . 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 3
2.1.1. Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 3
2.1.2. Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 5
2.1.3. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 6
2.2. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đước đôi . 8
2.2.1. Hình thái học . 8
2.2.2. Phân bố . 9
2.2.3. Vai trò của rừng đước . 9
2.3. Quy trình ly trích DNA thực vật . 9
2.3.1. Đánh giá chất lượng DNA . 11
2.4. PCR (Polymerase chain reaction) . 12
2.4.1. Khái niệm . 12
2.4.2. Nguyên tắc . 13
2.4.3. Ứng dụng . 13
2.4.4. ưu và nhược điểm . 13
2.5. Đa dạng di truyền . 14
2.5.1. Khái niệm . 14
2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền . 14
2.6. Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) . 15
2.6.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) . 16
2.6.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) . 17
2.6.3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) . 18
2.6.4. Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đước . 21
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM . 22
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện . 22
3.1.1. Thời gian thực hiện . 22
3.1.2. Địa điểm thực hiện . 22
3.2. Vật liệu thí nghiệm . 22
3.1.2. Mẫu đước đôi . 22
3.2.2. Hoá chất thí nghiệm . 23
3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm . 24
3.3. Phương pháp nghiên cứu . 25
3.3.1. Bố trí thí nghiệm . 25
3.3.2. Phương pháp ly trích DNA . 25
3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích . 28
3.3.4. Kỹ thuật RAPD . 30
3.3.5. Phương pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS . 34
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 36
4.1. Kết quả thu thập mẫu đước tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 36
4.2. Bảo quản mẫu . 36
4.3. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA . 37
4.4. Kết quả phản ứng RAPD – PCR . 44
4.4.1. Thí nghiệm 1 . 44
4.4.2. Thí nghiệm 2 . 45
4.4.3. Thí nghiệm 3 . 45
4.4.4. Thí nghiệm 4 . 46
4.4.5. Thí nghiệm 5 . 47
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 51
5.1. Kết luận . 51
5.2. Đề nghị . 51
TÀI LIÊU THAM KHẢO . 53
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT . 53
TÀI LIỆU TIẾNG NưỚC NGOÀI . 54
PHỤ LỤC
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-27-khoa_luan_hoan_thien_phuong_phap_va_nghien_cuu_su.3Z7X78ZKzw.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52560/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
2kb. Gel đƣợc đổ trên
giá thể nằm ngang và điện di theo phƣơng nằm ngang. Để phát hiện DNA trên gel
ngƣời ta dùng chất nhuộm ethidium bromide, chúng có khả năng xen vào giữa các
base của acid nucleic và phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại, acid nucleic sẽ hiện ra
dƣới dạng các vạch màu đỏ cam có thể chụp ảnh và ghi nhận lại.[8]
Dựa vào kết quả điện di: so sánh các băng với băng chuẩn có thể biết chất
lƣợng DNA ly trích nhƣ gãy, lẫn tạp.
Bảng 2.1 Phân tách các đoạn DNA trong gel theo kích thƣớc [8]
(Lê Đình Lƣơng, 2001)
(Lê Đình Lƣơng, 2001)
(Lê Đình Lƣơng, 2001)
2.4. PCR (Polymerase chain reaction)
2.4.1. Khái niệm
Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một
cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng
DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất
hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng tỉ bản sao DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc
thu nhận từ DNA mẫu. [6]
Loại gel Phạm vi phân tách (bp)
0,3% agarose 50.000 đến 1000
0,7% agarose 20000 đến 300
1,4% agarose 6000 đến 300
4% acrylamid 1000 đến 100
10% acrylamid 500 đến 25
20% acrylamid 50 đến 1
13
2.4.2. Nguyên tắc
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 25-35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các
bƣớc: Biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài.
Biến tính: đây là bƣớc làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn.
Nhiệt độ thiết kế là 940C
Gắn mồi: đây là bƣớc primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích (sợi đơn).
Nhiệt độ thay đổi từ 50 - 600C. Nhiệt độ trong bƣớc này tùy thuộc vào độ
dài của cặp primer.
Kéo dài: 720C, 60 – 90 giây. Đây là bƣớc kéo dài primer nhờ hoạt động
của Taq polymerase. Nhiệt độ 720C là tối ƣu cho hoạt động của Taq
polymerase.
Sau 25 - 35 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 720C trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản
phẩm PCR.
2.4.3. Ứng dụng
Đánh giá mức độ biến dị di truyền trong một loài sinh vật thông qua mức
độ biểu hiện đa hình.
Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các giống, giữa quần thể khác loài.
Thiết lập bản đồ di truyền thông qua các phƣơng pháp phân tích các kỹ
thuật trong sinh học phân tử nhƣ RAPD, STS, SSR, AFLP.
Nghiên cứu và phân tích gia phả của sinh vật.
Kiểm tra và xác định nguồn gốc con lai.
Thiết lập hệ thống phân loại phân tử thông qua các kỹ thuật sinh học phân
tử có liên quan.
Giải trình tự DNA.
Ứng dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen.
Chẩn đoán bệnh trong y khoa, chẩn đoán nhóm máu, phát hiện các bệnh
trong y khoa.
14
Phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng triệu năm. [6]
2.4.4. Ƣu và nhƣợc điểm
2.4.4.1. Ƣu điểm
Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện
đƣợc.
2.4.4.2. Nhƣợc điểm
Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong
một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hay chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì
phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính.
2.5. Đa dạng di truyền
2.5.1.Khái niệm
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gene giữa các cá thể trong cùng
một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gene có thể di truyền đƣợc
trong một quần thể hay giữa các quần thể. [18]
2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền
Việc nghiên cứu đa dạng di truyền có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến
lƣợc quản lý, bảo vệ và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ.
Kết quả quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ luôn luôn là
kế hoạch dài hạn. Từ 1978 – 1983 trồng phủ xanh bằng cây đƣớc (Rhizophora
apiculata), từ 1984 – 1999 trồng đa dạng loài để đạt đa dạng sinh học. Từ năm 2000
trở đi, quan sát động lực phát triển và mối quan hệ với các hệ sinh thái tiếp giáp,
theo dõi độ tăng đa dạng sinh học.[5]
Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đƣớc để tìm hiểu hệ số đồng dạng di
truyền, nhằm điều chỉnh kịp thời độ đa dạng di truyền của khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ. Bởi vì khi hệ số đồng dạng di truyền cao thì ảnh hƣởng
của các tác nhân nhƣ sâu bệnh là rất lớn và thiệt hai nếu xẩy ra là vô cùng nghiêm
trọng.
15
2.6. Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker)
Là những chỉ thị đƣợc tạo ra nhờ phƣơng pháp cắt DNA bằng enzym giới
hạn (Restriction enzyme) hay qua PCR. Các chỉ thị phân tử này có thể liên kết với
một gen nào đó nằm trên nhiễm sắc thể.
Các chỉ thị phân tử có nguồn gốc từ hai nhóm:
Chỉ thị phân tử dựa vào phƣơng pháp lai DNA: RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism), minisatelite.
Chỉ thị phân tử dựa vào phƣơng pháp PCR: RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism),
SSR (Simple Sequense Repeats/microsatellite repeats), STS (Sequence
Tagged Sites), DAF (DNA Amplification Fingerprinting). [7]
Bảng 2.2 Các loại chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền [2]
(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)
Tên đầy đủ
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
DAF DNA Amplification Fingerprinting
ALP Amplicon Length Polymorphism
SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite)
SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
AP-PCR Arbitrary Primer-PCR
SNP Single Nucleotide Polymorphism
STS Sequence – Tagged Sites
16
2.6.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
2.6.1.1. Định nghĩa
RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn,
biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra khi cắt DNA bằng
các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hay trong
các bào quan khác.[9]
2.6.1.2. Phƣơng pháp
Phƣơng pháp này cho phép so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi
cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn - nhằm tìm hiểu xem có hay không đột
biến điểm (Làm mất hay xuất hiện vị trí giới hạn) hay có hay không sự thay đổi
một đoạn trình tự DNA.
Trƣờng hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì
sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy các band DNA giống nhau
hoàn toàn về số lƣợng và kích thƣớc. Ngƣợc lại, nếu có đột biến điểm hay có thay
đổi một đoạn trình tự DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các band DNA.
Sự giống nhau hay khác nhau về các band DNA này đƣợc nhận biết qua ảnh
phóng xạ tự ghi hay đánh dấu probe.
2.6.1.3. Ứng dụng
Chỉ thị phân tử RFLP có thể đƣợc sử dụng trong một số nghiên cứu nhƣ:
Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể (Ghi nhận qua sự đa hình
DNA).
Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể
Lập bản đồ di truyền (Genetic map) phục vụ công tác chọn tạo giống (Thí
dụ nhƣ một số chỉ thị phân tử RFLP liên kết với gen quy định tính trạng số
lƣợng). [2]
17
2.6.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
2.6.2.1. Định nghĩa
AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết
hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử
dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có
thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng
