Download miễn phí Bê sinh ra từ trứng được nuôi chín và thụ tinh ngoài cơ thể mẹ
Để thu thập tế bào trứng, có thể nghiền nhỏ hay cắt buồng trứng
(Iwasaki, S.et al., 1987). Gần đây có? phương pháp mới để thu thập tế bào
trứng: dùng dao phẫu thuật rạch nang trứng, sau đó dùng một công cụ rất
nhỏ (trông giống chiếc thìa) xúc tế bào trứng ra, phương pháp này giúp thu
được nhiều tế bào trứng hơn (bảng 3). cần nghiên cứu sâu hơn nữa để
có thể thu thập và sử dụng được tất cả các tế bào trứng trên một buồng trứng.
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2014-06-04-be_sinh_ra_tu_trung_duoc_nuoi_chin_va_thu_tinh_ngo.YAFxD4qh4y.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-68669/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Bê sinh ra từ trứng được nuôi chín
và thụ tinh ngoài cơ thể mẹ
1 Giới thiệu
Động vật nhai lại đầu tiên được tạo ra từ kỹ thuật thụ tinh trong ống
nghiệm (IVF) là một con bê đực sinh năm 1981 (Brackett, B.G et al, 1982).
Các tế bào trứng của các loài động vật có vú có khả năng khôi phục sự phân
bào giảm nhiễm từ giai đoạn dictyate (một phần của prophase-Pha trước) tới
metaphase II khi chúng được lấy ra khỏi nang trứng và nuôi trong môi
trường phù hợp. Hiện tượng này được gọi là quá trình nuôi chín in vitro do
Pincus và Enzmann báo cáo từ 1935. Các tế bào trứng được nuôi chín in
vitro (IVM) có thể phát triển thành phôi? nếu đem cấy truyền vào một bò cái
đã được dẫn tinh trước đó, sau đó cấy trở lại vào một con nhận khác khi phôi
đạt tới giai đoạn phôi nang, mặc dù đã có báo cáo rằng các tế bào trứng sau
khi nuôi chín in vitro không thể tạo ra tiền nhân đực sau khi IVF và không
thể tiếp tục phát triển thêm nữa.
ở Nhật, con bê đầu tiên được tạo ra sau khi IVM và IVF vào năm
1985 (Hanada, A., Suzuki, T., Shioya, Y., 1986). Đây là một thành tựu rất
đáng chú ý vì đã đưa ra được phương pháp tiến hành cụ thể, thu được kết
quả trong cùng thời gian tạo được nhiều phôi và phôi có thể phát triển thành
bê. Phương pháp này làm giảm giá thành rất nhiều trong công nghệ cấy
truyền phôi.
Để thu được các phôi nang bằng phương pháp không phẫu thuật,
người ta dùng ống dẫn trứng thỏ làm nơi nuôi cấy tạm thời. Bây giờ mọi
người đã biết các phôi có nguồn gốc từ các tế bào trứng bò sau khi IVM/
IVF, có thể phát triển thành phôi nang khi nuôi cấy trong môi trường TCM
199 có bổ sung huyết thanh bò.
Mục đích chính của bài báo này là điểm lại kết quả của việc tiến hành
tạo phôi từ tế bào trứng bò bằng phương pháp IVM/IVF tại Viện Chăn nuôi
quốc gia (National Institute of Animal Industry - NIAI) của Nhật Bản.
2 Quy trình chung
Buồng trứng bò được thu thập từ lò mổ địa phương, đặt trong nước
muối sinh lý ấm có bổ sung 100 UI penicillin (Penicillin G Kali kết tinh,
Meiji Conf. Co., Japan), 100 mg streptomycin/ml (streptomycin sulfate,
Meiji Conf. Co.) và chuyển về phòng thí nghiệm của NIAI trong vòng 2 giờ.
Dùng xơ-ranh với kim 18-G hút các tế bào trứng từ các nang trứng
nhỏ (dưới 5mm). Dịch hút được cho vào môi trường PBS Dulbecco?s có bổ
sung 3mg albumin huyết thanh bò/ml (Fraction V, Miles, Naperville, USA)
và kháng sinh tố.
Lựa chọn các tế bào trứng dựa trên độ dày mỏng và độ rắn chắc của
các lớp tế bào cumulus bao xung quanh. Đem nuôi cấy trong 100 ml dung
dịch có chứa 25mmol HEPES bufered TCM 199 (Gibco, Grand Island,
USA) đã được bổ sung 10% huyết thanh bò và 0,002 AU FSH (Antrin,
Denka Pharma. Co., Japan) và 1 mg estradiol/ml (17b-estradiol, Sigma
Chem. Co., USA) dưới một lớp dầu phủ (Squibb và Sons Inc., USA) trong
20-22 giờ. Điều kiện không khí nuôi cấy gồm 5% CO2? và 95% không khí
đã được làm ẩm ở 390C.
Để tiến hành hoạt hoá, tinh trùng được giải đông và cho vào ống
10ml, sau đó trộn với 10ml Caff-BO (modified DM of Brackett and
Oliphant, 1975) (Takahashi, Y. và Hanada, A., 1984) và 10 mmol Natri
Caffein Benzoat), không bổ sung albumin huyết thanh bò.?
Sau đó tinh trùng được đem ly tâm với tốc độ 500 G trong 5 phút, hút
lấy phần nổi và cho vào dung dịch Caff-BO, ly tâm lại lần nữa và hút lấy
phẩn nổi. Cục tinh trùng nổi được cho vào 0,5-1,0 ml Caff-BO và nồng độ
tinh trùng được đếm và điều chỉnh trong khoảng 1x107 đến 2x107 tinh
trùng/ml. Tinh trùng sau khi đã điều chỉnh pha loãng với BSA-BO-Hep
(modified DM of Brackett and Oliphant, 1975) với 20 mg BSA tinh thể
(Sigma Chem. Co., USA) và 5-10 ml heparin/ml (Novo Heparin, Novo
Industry A/S, Denmark)) theo tỷ lệ 1:1. Tinh trùng (0,1ml) được phủ dầu mỏ
lên trên và đem ủ trong 15 phút ở 390C trong điều kiện 5% CO2 và 95%
không khí ẩm.
Các tế bào trứng sau khi nuôi cấy được chuyển vào giọt tinh trùng để
thụ tinh. Sau khi ủ hỗn hợp tinh trùng-tế bào trứng trong thời gian 4-6 giờ,
các tế bào trứng này được chuyển vào môi trường nuôi cấy để phân chia và
phát triển. Môi trường nuôi cấy bao gồm 25 mmol HEPES buffered TCM
199 có bổ sung 10% huyết thanh bò và các kháng thể.
Nhặt một số tế bào trứng và loại bỏ tế bào cumulus, cho vào lam kính
loại 4-wax-spot và trộn với axit alcohol-axetic để kiểm tra khả năng hoạt hoá
của tinh trùng và khả năng tạo tiền nhân sau khi thụ tinh 10-18 giờ.
Các tế bào trứng còn lại được nuôi cấy và kiểm tra? sự phân chia ở
ngày thứ 3 hay thứ 4 (ngày 1 là ngày thụ tinh). Để kiểm tra, các lớp tế bào
cumulus được loại bỏ bằng pipet một cách nhẹ nhàng. Các phôi có sự phân
chia được nuôi cấy trong cùng một đĩa và có thể quan sát sự phát triển của
phôi nang trong vòng 7-10 ngày.
3 Kết quả
3.1. Thu hoạch các buồng trứng ở lò mổ
Các buồng trứng được chuyển về phòng thí nghiệm ở các điều kiện 40,
230 và 380C trong vòng 2-4 giờ sau khi gia súc chết. Các tế bào trứng từ
buồng trứng để ở 40C cho thấy sự giảm sút đáng kể khả năng phát triển
thành blastocyt sau khi tiến hành IVM/IVF. Nếu vận chuyển ở điều kiện
250C sẽ có ưu điểm hơn so với 380C, đó là tỷ lệ phát triển của phôi nang
biến động từ 15,5% (37/239) tới 20,5% (39/190) (Tsukamoto, A. et al.,
1989) (bảng 1 và 2)
Bảng 1.? ảnh hưởng của nhiệt độ nước muối sinh lý sử dụng để vận
chuyển buồng trứng tới sự phát triển thành phôi nang sau khi IVM/IVF
Bò Nhiệt độ
nước muối (0C)
Số tế bào
trứng sử dụng
Tỷ lệ
phân chia (%)
Phôi
nang (%)
Toch 38
23
177
190
77,4
71,6
23
(13,0)
39
(20,5)
688 38
23
293
239
53,2
51,5
24
(8,2)a
37
(15,5)b
a, b thể hiện sự sai khác rõ rệt (P<0,01),? c2-test
Có thể vận chuyển buồng trứng về phòng thí nghiệm trong thời gian
dài vì 16,0% (109/683) tế bào trứng thu được từ buồng trứng ở 200C trong
vòng 8 giờ vẫn có thể phát triển thành phôi nang (Abe & Shioya, 1991,
không xuất bản).
Bảng 2.? ảnh hưởng của việc dùng nước muối sinh lý ở nhiệt độ thấp
khi vận chuyển buồng trứng tới tỷ lệ phát triển thành phôi nang sau khi
IVM/IVF
Nhiệt độ nước
muối (0C)
Số tế bào
trứng sử dụng
Tỷ lệ phân
chia (%)
Số phôi
nang và (%)
23 470 71,3a 102
(21,7)a
4 506 34,0b 33 (6,5)b
a, b thể hiện sai khác rõ rệt (P<0,01)
3.2. Thu thập và lựa chọn tế bào trứng để nuôi chín
3.2.1. Thu thập tế bào trứng
Mặc dù có tới 40 nang trứng nhỏ trên bề mặt một cặp buồng trứng
nhưng dùng xơ-ranh và kim cũng chỉ hút được khoảng 20 tế bào. Chỉ có 1/3
số tế bào trứng thu được còn nguyên màng cumulus bao xung quanh và thích
hợp cho IVM/IVF (Kurosaka, S. et al., 1987).
Giai đoạn của chu kỳ động dục không ảnh hưởng tới số lượng tế bào
trứng thu được và các tế bào trứng thu được từ các giai đoạn động dục khác
nhau đều phát triển thành phôi nang sau khi IVM/IVF (Kurosaka, S. et al.,
1987).
Để thu thập tế bào trứng, có thể nghiền nhỏ hay cắt buồng trứng
(Iwasaki, S. et al., 1987). Gần đây có? phương pháp mới để thu thập tế bào
trứng: dùng dao phẫu thuật rạch nang trứng, sau đó dùng một công cụ rất
nhỏ (trông giống chiếc thìa) xúc tế bào trứng ra, phương pháp này giúp thu
được nhiều tế bào trứng hơn (bả...
