Chương IV: Kết quả và biện luận
4.1 Kết quả các chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa chưa thủy phân (nguyên
liệu ban đầu)
Bảng 4.1 : Chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa
Khoáng 4,277%
Canxi 0,63%
Photpho 1,59%
Đạm 9,835%
Độ ẩm 73,531%
4.2 Thu nhận enzyme trước tinh sạch
Lấy 400 g chế phẩm enzyme thô thêm 1200ml nước cất (tỷ lệ 1:3) khuấy
trong 30 phút, lọc thô qua vải, lặp lại quá trình này 3 lần. Gom các dịch lọc
mang ly tâm ở tốc độ 6000/ phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô, bảo quản
dịch chiết thô này trong tủ lạnh ở 4
0
C
Bảng 4.2: Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết
enzyme thô của nấm mốc Asp.awamori
Hoạt tính enzyme (U/g CP) Hàm lượng protein (mg/g CP) HTR (U/mg)
82,3 37,15 2,215
4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
4.3.1 Ảnh hưởng của pH
Mỗi loại enzyme có một giới hạn nhất định về pH. Để thu được nhiều
protein hòa tan ta phải tạo điều kiện thích hợp nhất cho quá trình thủy phân cơ
chất. Chính vì vậy ta cần khảo sát pH tối ưu để thủy phân trong điều kiện ở
nhiệt độ (37
0
C)
Bảng 4.3: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của pH
1
Chương IV: Kết quả và biện luận

nhiệt độ nhất định, khoảng nhiệt độ này không làm cho protein bị biến tính,
mất hoạt tính sinh học. Khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng enzyme xúc tác
tăng. Nếu cứ tiếp tục tăng nhiệt độ đến mức nào đó thì một mặt vận tốc phản
ứng tăng theo nhiệt độ thông thường, một mặt ở nhiệt độ cao thì protein của
enzyme bắt đầu bị biến tính mạnh mẽ, hoạt tính xúc tác sẽ giảm nhanh, lúc này
vận tốc phản ứng cũng tiến dần đến 0. Do vậy trong trường hợp này khi hoạt
độ của enzyme đạt giá trị cao nhất thì lúc này nhiệt độ đạt giá trị tối ưu
Từ đồ thị 4.2 cho thấy enzyme protease hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ
40
0
C (213,152U/g CP). Vượt quá nhiệt độ này hoạt tính enzyme giảm và đặc
biệt giảm mạnh ở 70
0
C do sự biến tính protein
4.3.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt
Bảng 4.5: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của độ bền nhiệt
Độ bền nhiệt ( phút) Hoạt tính(U/g CP) Phần trăm theo hoạt tính (%)
0 phút 237,234 100
10 phút 205,249 86,52
20 phút 191,932 80,9
30 phút 174,064 73,37
40 phút 163,741 69,02
50 phút 153,642 64,76
60 phút 150,798 63,57
Đồ thị 4.3 : Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme
3
Chương IV: Kết quả và biện luận
Nhận xét:
Trong quá trính thủy phân thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài
hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Trong đó thời gian thủy phân cần đủ dài

Amano
Hoạt tính (U) Hàm lượng (mg) Hoạt tính riêng (U/mg)
58,87 8,977 6,55
4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của mẫu enzyme
5
Chương IV: Kết quả và biện luận
Đồ thị 4.5 :Đồ thị sắc ký lọc gel
Qua sắc kí ta thu được 3 peak
Peak 1: từ ống 15- ống 21
Peak 2: từ ống 21- ống 25
Peak 3: từ ống 30- ống 52
Xác định hàm lượng và hoạt tính cho từng peak. Tuy nhiên hoạt tính và hàm
lượng protein của peak 3 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa
protease quan tâm
Bảng 4.7: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính sau khi tinh sạch
Hoạt tính enzyme (U/g CP) Hàm lượng protein (mg/g CP) HTR (U/mg)
56,76 9,62 5,9
Nhận xét:
6
Chương IV: Kết quả và biện luận
Sau khi tinh sạch enzyme qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng
protein khi sau khi khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng protein trước khi tinh
sạch. Hoạt tính của enzyme sau khi tinh sạch cũng giảm so với mẫu enzyme
trước tinh sạch.
Kết quả như vậy là do trong protein của ta có chứa protein tạp nên hàm
lượng sau tinh sạch thấp hơn hàm lượng trước tinh sạch. Sau khi tinh sạch thì
protein tạp bị loại bỏ, nên hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch tăng hơn
nhiều so với hoạt tính riêng của enzyme trước tinh sạch
Bảng 4.8: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính của enzyme
Mẫu enzyme ⅀ Hoạt

Giếng 5: Enzyme của hãng Amano
Vì hoạt tính peak 1 quá thấp nên ta không xác định trọng lượng phân tử của
protein enzyme của peak 1. Ta chỉ quan tâm tới peak 2 và peak 3
8
Chương IV: Kết quả và biện luận
Bảng 4.9:Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein trong thang chuẩn
Rf Trọng lượng phân tử (Dalton) Log ( trọng lượng phân tử)
0,147 150000 5,176
0,258 100000 5,00
0,276 75000 4,875
0,345 50000 4,699
0,414 35000 4,544
0,552 25000 4,398
0,621 15000 4,176
Đồ thị 4.7: Sự tương quan giữa log của trọng lượng phân tử và giá trị Rf
Phương trình tuyến tính thu được
Y = -2.0597x + 5.4641
Trong đó: y=log (trọng lượng phân tử protein)
X=Rf Tỷ số khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di
chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tích
Từ phương trình tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lượng phân
tử của protein
Trọng lượng phân tử protein = 10
y
Giá trị Rf từng vạch của mỗi ba peak và trong mẫu thô
Bảng 4.10: Giá trị Rf từng vạch của của mỗi peak trong mẫu
Vạch Peak 2 Peak 3 Mẫu thô Hãng Amano
1 0,155 0,158 0,138 0,138
2 0,224 0,379 0,19 0,259
3 0,259 Không có 0,224 Không có

Nhận xét:
10
Chương IV: Kết quả và biện luận
Ta có thể so sánh trọng lượng phân tử protein của mẫu enzyme trước và sau
khi tinh sạch
Dựa vào hình 4.1: Mẫu enzyme thô có chứa nhiều vạch và có màu đậm, do
trong mẫu có chứa protein tạp vì vậy trong giếng của mẫu enzyme thô có nhiều
vạch ảnh hưởng đến enzyme
Vì vậy khi xác định trọng lượng phân tử của protein ta nên xác định bằng
mẫu protein đã được tinh sạch vì nó không chứa nhiều protein tạp không ảnh
hưởng nhiều đến trọng lượng phân tử của protein mà ta quan tâm
4.6 Kết quả thủy phân nội tạng cá:
4.6.1 Thủy phân ở 40
0
C
4.6.1.1 Hàm lượng protein phương pháp Biure
Bảng 4.15: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 40
0
C
Thời gian
thủy phân
Nồng độ enzyme
0,5% 0,7% 0,9% 1,1%
0h
2.32 2.49 2.51 2.66
1h
2.87 2.91 3.33 3.37
2h
3.08 3.13 3.96 4.06
3h

C
Bảng 4.16: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 40
0
C
Thời gian
thủy phân
Nồng độ enzyme
0,5% 0,7% 0,9% 1,1%
0h 5.22 5.85 5.95 6.23
1h 6.42 6.94 7.63 7.32
2h 6.89 7.23 8.06 8.17
3h 7.27 7.25 8.83 8.63
4h 7.47 7.49 9.22 9.64
5h 7.63 7.68 9.51 9.79
6h
7.91 7.93 9.65
10.1
1
7h
8.22 8.26 9.75
10.2
5
8h
8.24 8.8 9.85
10.3
1
9h
8.39 9.04 9.95
10.4
9

Nồng độ enzyme
0,5% 0,7% 0,9% 1,1%
0h 1.52 1.45 1.42 1.34
1h 1.91 1.84 1.71 1.66
2h 2.43 2.05 1.91 1.81
3h 2.65 2.29 2.04 1.89
4h 2.86 2.46 2.15 1.97
5h 3.14 2.59 2.53 2.23
6h 3.39 2.95 2.74 2.37
7h 3.88 3.37 3.04 2.69
8h 4.94 4.47 4.21 3.82
9h 5.36 4.69 4.55 3.94
10h 5.54 4.91 4.61 4.07
Đồ thị 4.10: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 40
0
C
Nhận xét:
13
Chương IV: Kết quả và biện luận
Dựa vào đồ thị 4.10 ta thấy hàm lượng NH
3
ở nồng độ 0,5% sinh ra mạnh
nhất. Tại nồng độ enzyme này thì cơ chất chưa bị thủy phân gây nên mùi hôi.
Thời gian có ảnh hưởng rất lớn đến thời gian thủy phân, thời gian phải
thích hợp để enzyme thủy phân hết cơ chất. Với nồng độ enzyme cao thì cơ
chất bị thủy phân nhanh hơn vì thế ở nồng 0,7%, 0,9%,1,1% thì lượng NH
3
sinh ra thấp hơn lượng NH

C
Nhận xét:
Nồng độ enzyme 0,9% có hàm lượng protein cao nhất.
14
Chương IV: Kết quả và biện luận
Vì nồng độ enzyme khác nhau nên lượng protein tạo ra trong quá trình thủy
phân cũng khác nhau. Đối với nồng độ 0,5% thì enzyme thấp không thủy phân
hết cơ chất ban đầu nên hàm lượng protein sinh ra thấp hơn hàm lượng protein
của các nồng độ khác
Lượng protein của nồng độ 0,9% tương đương với lượng protein của nồng
độ 1,1% . Nếu thủy phân với nồng độ 1,1% thì lượng protein cũng ngang
ngang nhau mà ta phải tốn thêm enzyme điều đó gây lãng phí
Vì thế khi thủy phân thì ta nên chọn nồng độ enzyme 0,9% .
4.6.2.2 Hàm lượng đạm amin
Bảng 4.19: Hàm lượng đạm amin ở 50
0
C
Thời gian
thủy phân
Nồng độ enzyme
0,5% 0,7% 0,9% 1,1%
0h
4.2 5.42 5.56 6.77
1h
5.25 6.64 7.89 7.95
2h
5.84 8.96 9.82 9.96
3h
6.09 10.05 10.6 11.85
4h

3
ở nhiệt độ 50
0
C
Thời gian
thủy phân
Nồng độ enzyme
0,5% 0,7% 0,9% 1,1%
0h 0.58 0.49 0.46 0.43
1h 0.8 0.66 0.51 0.54
2h 0.91 0.81 0.53 0.61
3h 0.94 0.89 0.65 0.69
4h 1.15 0.97 0.72 0.76
5h 1.3 1.23 0.84 0.84
6h 1.54 1.47 0.99 0.91
7h 1.84 1.79 1.08 1.07
8h 3.93 3.02 2.44 1.87
9h 4.69 3.74 2.96 2.43
10h 4.98 3.97 3.54 2.73
Đồ thị 4.13: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 50
0
C
Nhận xét:
16
Chương IV: Kết quả và biện luận
NH
3
gây ra mùi hôi thối nên khi thủy phân hay các quá trình liên quan đến

4h 3.15 4.78 5.88 5.75
5h 3.67 5.26 6.43 6.48
6h 3.97 5.47 6.95 6.74
7h 4.43 5.96 7.16 6.95
8h 4.78 6.36 7.31 7.37
9h 5.07 6.44 7.41 7.65
10h 5.35 6.61 7.58 7.67
Đồ thị 4.14: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở nhiệt độ 60
0
C
Nhận xét:
Hàm lượng protein của các nồng độ enzyme tăng đều theo từng mốc thời
gian.
17
Chương IV: Kết quả và biện luận
Lượng protein ở mốc thời gian 10h tăng 3,26 lần so với mốc thời gian 0h ở
nồng 0,5%
Ở nồng độ enzyme 0,7%,lượng protein tăng 3,35 lần vào mốc thời gian 10h
so với mốc thời gian 0h
Ở cùng mốc thời gian 10h tăng 3,54 lần ở nồng độ 0,9% và tăng 3,44 lần so
với lượng protein ban đầu
Cùng mốc thời gian như nhau nhưng sự gia tăng hàm lượng protein khác
nhau nên ta sẽ chọn nồng độ enzyme nào có sự tăng nhiều nhất để thủy phân
Vì vậy ta chọn nồng độ 0,9% trong quá trình thủy phân
4.6.3.2 Hàm lượng đạm amin
Bảng 4.22: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 60
0
C
Thời gian
thủy phân

.6.3.3 Hàm lượng NH
3
Bảng 4.23: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 60
0
C
Đồ thị 4.15: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 60
0
C
Nhận xét:
19
Thời gian
thủy phân
Nồng độ enzyme
0,5% 0,7% 0,9% 1,1%
0h
0.11 0.13 0.11 0.12
1h
0.17 0.15 0.17 0.24
2h
0.28 0.24 0.23 0.44
3h
0.68 0.66 0.35 0.68
4h
0.98 0.74 0.44 0.89
5h
1.36 0.98 0.68 1.44

Vì thế khi tiến hành thủy phân không nên kéo dài thời gian thủy phân quá
lâu sẽ gây ra mùi hôi thối ảnh hưởng đến sản phẩm thu được. lượng NH
3
đạt
giá trị cao nhất ở nồng độ 0,5%
20