Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN
NGUYỄN HÀ GIANG

TIÊU CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU SINH HÓA CỦA
VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TẠI KHOA THỦY SẢN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

liệu nghiên cứu khác. Qua đó, đề xuất các chủng vi khuẩn A. hydrophila tham
khảo cùng với phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa dùng để khi
định danh vi khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường
Đại học Cần Thơ. Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được chọn để định
danh dựa theo hệ thống phân loại của Baumann et al(1984). Các đặc điểm sinh lý,
sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham,
1993) và phương pháp của West và Colwell (1984). Tám chủng Aeromonas
hydrophila (A. hydrophila) gồm CAF 2 (LMG 2844, chủng chuẩn), CAF 23,
CAF25, CAF 131, CAF 132, CAF 133, CAF 134 và CAF 135 là các chủng đã
được phân lập và định danh từ các đề tài trước và được trữ trong tủ âm 80
0
C
Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Các chủng A. hydrophila đều là vi
khuẩn gram âm, hình que ngắn, di động, catalase dương tính, oxidase âm tính và
có khuẩn lạc dạng tròn, nhẵn. Đặc điểm khác cơ bản ở các chủng A. hydrophila
này với các nghiên cứu trước là các chủng đều cho kết quả oxidase âm tính.
Phương pháp định danh truyền thống và API 20E thể hiện ở các chỉ tiêu giống
nhau thì kết quả thể hiện giống nhau nhưng chỉ khác ở phản ứng của các chủng
nghiên cứu đối với chỉ tiêu arginine và ornithine trong cùng điều kiện phòng thí
nghiệm. Các chủng nghiên cứu qua kiểm tra bằng phương pháp PCR (Panangala
et al, 2007) chưa cho sản phẩm đặc hiệu (không hiện vạch 209bp).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
iii

MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1
GIỚI THIỆU 01
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 03

4.2 Thảo luận 26
PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 29
5.1 Kết luận 29
5.2 Đề xuất 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO 30
PHỤ LỤC 35
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
v

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Các nguồn vi khuẩn 13
Bảng 3.2: Bảng đọc kết quả bộ kít API 20E 16
Bảng 3.3: Thành phần tham gia phản ứng PCR 17
Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của chủng vi khuẩn
chuẩn và 7 chủng tham khảo 19
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng bộ kít API 20E chủng vi khuẩn chuẩn
và 7 chủng tham khảo 24
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
vi

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 3.1 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR theo
quy trình Panangala et al (2007) có chỉnh sửa 18
Hình 4.1 Hình dạng A. hydrophila (100X) 21
Hình 4.2 A. hydrophila trên môi trường TSA 21
Hình 4.3 A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar 22
Hình 4.4 Phản ứng citrate (+) 22

Đề tài “Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa
của vi khuẩn Aeromonas hydrophila” được thực hiện tại Khoa Thủy sản nhằm
mục đích tìm hiểu những chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa sai khác từ phương pháp
truyền thống và sử dụng kít API 20E. Đồng thời cũng so sánh với những kết quả
định danh của các nghiên cứu trước đây tại bộ môn. Mục đích cuối cùng của đề
tài là đề xuất các chủng vi khuẩn A. hydrophila tham khảo cùng với phương pháp
xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa dùng định danh vi khuẩn trong điều kiện
phòng thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 2
Đề tài được thực hiện với các nội dung sau:
- Kiểm tra các chỉ tiêu về sinh lý và sinh hóa vi khuẩn A. hydrophila bằng
phương pháp truyền thống;
- Kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa vi khuẩn A. hydrophila sử dụng bộ kít
API 20E;
- Dùng phương pháp PCR phát hiện các chủng vi khuẩn A. hydrophila được
định danh bằng phương pháp sinh hóa.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Bệnh trên động vật thủy sản
Khác với các hình thức nuôi và thu hoạch khác cây trồng và vật nuôi đều nhìn
thấy được, các động vật thủy sản cần được chú ý nhiều hơn để theo dõi sức khỏe
của chúng. Chúng không dễ quan sát thấy được, trừ khi nuôi ở trong bể, và chúng
lại sống trong một môi trường phức tạp và biến động. Ngoài ra, việc tiêu thụ thức
ăn và tử vong có thể đều ẩn náu kỹ ở dưới nước. Mặt khác, nuôi trồng thủy sản có
một lượng loài nuôi và môi trường nuôi đa dạng.
Hiện nay bệnh cho là một trong những thách thức quan trọng nhất mà ngành nuôi
trồng thủy sản đang phải đang đối mặt. Số lượng các bệnh tìm thấy trong nuôi

mắt; vàng da; nấm thủy mi; xuất huyết đường ruột, ký sinh trùng;…. cũng được
ghi nhận trong khảo sát này.
Ngoài ra, trong Báo cáo dịch bệnh của Sở thủy sản An Giang 9 tháng đầu năm
2007 bệnh xuất hiện rải rác ở tất cả các tháng và tập trung nhiếu nhất vào đầu
mùa nước đổ (khoảng cuối tháng 6 đến đầu tháng 8). Cũng từ báo cáo này ghi
nhận được một số bệnh trên các đối tượng nuôi chính ở tỉnh (cá tra, cá lóc, cá
điêu hồng,…) như: bệnh đốm trắng ở gan thận (do vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri); bệnh xuất huyết, lở loét, đốm đỏ (do vi khuẩn: Aeromonas hydrophila,
Pseudomonas sp., Streptococus sp. ); bệnh trắng gan-trắng mang; bệnh do ký sinh
trùng (trùng bánh xe, trùng quả dưa, sán lá 16 móc, sán dây, sán lá song chủ,…).
Đặc biệt, trong các bệnh trên thì bệnh đốm trắng ở gan, thận và bệnh trắng gan-
trắng mang có tỷ lệ chết ở cá nhỏ vào mùa nước đổ có thể đến 50%.
2.2 Bệnh do vi khuẩn trên động vật thủy sản
Vi khuẩn là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản mà
chủ yếu thường gặp nhất là nhóm vi khuẩn gram âm. Tác nhân vi khuẩn có thể
được coi là tác nhân sơ cấp hoặc là tác nhân thứ cấp gây bệnh cho các loài thủy
sản (Inglish et al, 1993).
Theo tài liệu của G. Post vi khuẩn gây bệnh trên cá được phát hiện đầu tiên vào
năm 1894. Vi khuẩn ở động vật thủy sản đã phân lập được vài trăm loài gây bệnh
thuộc 9 họ, nhóm vi khuẩn điển hình là nhóm vi khuẩn Aeromonas sp.,
Pseudomonas sp. gây bệnh ở vùng nuôi nước ngọt (Bùi Quang Tề và Phạm Thị
Yên, 2002).
Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004), đã phân lập từ 181 mẫu cá tra bệnh mủ gan
thu được 108 dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Mẫu thu từ các vùng nuôi cá
tra phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ (huyện Thốt Nốt và
huyện Phụng Hiệp). Từ năm 1998 bệnh mủ gan phát hiện đầu tiên trên cá tra nuôi
ở Đồng bằng sông Cửu Long và gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of Pagasius)
(Ferguson et al, 2001). Ngoài ra, vi khuẩn này cũng là nguyên nhân gây bệnh
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 5

khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng. Nhóm vi khuẩn A.
hydrophila, A. sobria và A. caviae có các đặc điểm là có khả năng di động, 2 đầu
hơi tròn, gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở
37
0
C Nhóm thứ hai là A. salmonicida (3 loài phụ gồm: A. salmonicida, A.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 6
achromogenes và A. nova) có đặc điểm tương tự nhưng chúng chỉ phát triển tốt
nhất ở 22
0
C hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả
năng di động.
Bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas sp. đã gây thiệt hại không kém nghiêm trọng
cho nghề nuôi thủy sản nước ngọt ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói
chung. Bệnh nhiễm trùng máu (bệnh đốm đỏ, xuất huyết…) do nhóm vi khuẩn
này gây ra và thường gặp ở các động vật thủy sản nước ngọt như: trắm cỏ, ba sa,
chép, tai tượng, Mặt khác, chúng còn có thể gây bệnh ở ba ba, cá sấu, bệnh đỏ
chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng xanh. Tỷ lệ tử vong thường từ 30-70% (Đỗ Thị
Hòa và ctv, 2004). Ngoài ra, Bộ môn bệnh động vật thủy sản Viện nghiên cứu
Nuôi trồng thủy sản I cũng phân lập vi khuẩn gây bệnh chủ yếu trên nhiều loài
nuôi thủy sản là A. hydrophila 57,5%, A. caviae 25% và Pseudomonas
flourescens 17,5% (Bùi Quang Tề và Phạm Thị Yên, 2002).
Nhóm gây bệnh thường gặp là A. hydrophila, A. caviae, A. sobria được phát hiện
đầu tiên trên cá chình trong báo cáo dịch bùng phát bệnh của Sanarelli (1891). Kế
đến trong các nghiên cứu sau trên cá chép của Schaperclaus (1930), phân lập
được vi khuẩn A. hydrophila và cho đây là tác nhân gây bệnh cho cá (trích dẫn
của Inglis et al, 1993).
Gần đây, thiệt hại do nhóm vi khuẩn này lại được phát hiện trong ghi nhận của
Phan Anh (09/01/2006), Đồng Tháp là tỉnh bị thiệt hại lớn nhất do trong hơn 1

nhiều thiệt hại và trở thành mối nguy cho người nuôi cá ở khu vực Châu Á-Thái
Bình Dương. Theo thống kê của một số công trình nghiên cứu bệnh trên nhiều
loài cá bệnh ở Trung Quốc vi khuẩn phân lập được khoảng 42% đều là A.
hydrophila (Nielsen et al, 2001). Bên cạnh đó, bệnh đốm đỏ cũng đe dọa đến sản
xuất cá ở Bangladesh. Theo Chowdhury (1998) trong 150 cuộc điều tra ở ao nuôi
và 40 trại cá khắp Bangladesh có 50-60% bệnh đốm đỏ, 40-70% xuất hiện chấm
đỏ trên da và các vết thương khác chiếm 20-30%, vây và đuôi bị thối rửa là 10-
20%.
Ở Việt Nam bệnh xuất huyết xuất hiện ở hầu hết các tỉnh, trên các loài cá như:
trắm cỏ, chép, rô phi, mè, trê. Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh là do vi
khuẩn A. hydrophila, ngoài ra còn do một số loài vi khuẩn khác (A. sorbia,
Pseudomonas flourescens, ) (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005). Bệnh xảy ra quanh
năm nhưng thường tập trung vào mùa Xuân và mùa Thu ở miền Bắc, ở miền Nam
nhưng tần số xuất hiện cao nhất là đầu mùa mưa (giao mùa) và tỉ lệ tử vong từ
30-70%. Bệnh có thể xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá (Từ Thanh
Dung và ctv, 2005).
Ngoài ra, trong nghiên cứu của Cipriano et al (2001) còn thấy hiện tượng cá chép
(Cyprinus carpio) và cá vàng (Carassius auratus) vảy bị xù lên cùng với hiện
tượng xuất huyết trên da. Trong khi đó, qua khảo sát của Nguyễn Thành Tâm
(2006) ở Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long và Long An thì phân lập được A.
hydrophila trên cá rô đồng (Ansbas rtestudineus) bị xù vảy chiếm 50% và trên cá
khoẻ (trong ao nuôi cá bệnh) là 10%. Mặt khác, A. hydrophila không chỉ là tác
nhân chính gây ra bệnh trên các sinh vật mà còn là tác nhân thứ cấp gây bệnh,
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 8
chẳng hạn như cùng A. caviae gây bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng (Nguyễn
Thị Như Ngọc, 1997).
Vi khuẩn A. hydrophila không những gây ảnh hưởng cho nghề cá mà chúng còn
gây ảnh hưởng không kém trên giáp xác (tôm càng xanh). Bệnh do vi khuẩn này
xảy ra trên tôm càng xanh thường là bệnh đốm nâu. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ

trên còn có tác giả đã nghiên cứu về loài vi khuẩn này dựa vào phương pháp này
như Austin và Austin (1993), ở bài viết này thể hiện rõ hơn về các phản ứng sinh
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 9
lý cũng như sinh hóa nhưng về nhóm vi khuẩn Aeromonas di động thì nghiên cứu
nhiều hơn đối với A. hydrophila. Bên cạnh đó tác giả còn sử dụng phương thức
khác để định danh vi khuẩn (bộ kít API 20E, ELISA,…) đồng thời sử dụng các
hóa chất trong nghiên cứu đa số đều ghi hãng cung cấp (Difco, Oxoid, ). Một tài
liệu khác có liên quan đến loài vi khuẩn A. hydrophila là “Bacterial diseases of
fish” (Inglis et al, 1993), các nhà khoa học cũng đưa ra những kết quả định danh
bằng phương pháp truyền thống tương tự của Austin và Austin (1993), nhưng
phần miễn dịch học (về huyết thanh, kháng thể,…) được nghiên cứu sâu hơn.
Một nghiên cứu gần đây của Buller (2004) là đã dùng phương pháp định danh
truyền thống với 41 chỉ tiêu và bộ kít API 20E cho các chủng chuẩn A.
hydrophila để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa. Cùng với việc định danh
này thì theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) cũng đã dùng phương pháp truyền
thống kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và sinh lý với 41 chỉ tiêu. Nghiên cứu này
có sự kết hợp định danh giữa các chủng vi khuẩn chuẩn và các chủng phân lập thể
hiện mối quan hệ qua sơ đồ gia phả.
Cùng sử dụng phương pháp truyền thống để định danh vi khuẩn A. hydrophila,
các nghiên cứu ở Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ cũng được thực
hiện. Chẳng hạn như, Báo cáo khoa học của Nguyễn Thị Thu Hằng (2005), đề tài
“Khảo sát bệnh ký sinh trùng và vi khuẩn trên tôm càng xanh nuôi trong ao và
ruộng lúa mật độ thấp” của Nguyễn Tấn Đạt (2002), luận văn về thử nghiệm
vaccin phòng bệnh xuất huyết trên cá chép của Đoàn Nhật Phương (2001),… Gần
đây, trong Báo cáo khoa học Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) đã sưu tầm và thiết
lập hệ thống lưu trữ các loài vi khuẩn phân lập trên tôm, cá bệnh thu được từ các
đề tài và dư án thực hiện trước tại Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ. Từ
kết quả nghiên cứu trên thu được đa số là hai giống vi khuẩn Vibro và
Aeromonas. Trong đó, các chủng vi khuẩn được định danh trước và sau khi sưu

Polymorphic DNA-RAPD) (Laganowska et al, 2004, trích dẫn của Đặng Thị
Hoàng Oanh, 2006).
Gần đây nghiên cứu kỹ thuật multiplex-PCR (m-PCR) đang được phát triển và
ứng dụng do đặc điểm phát hiện đồng thời nhiều loại mầm bệnh vi khuẩn khác
nhau và tiết kiệm thời gian lẫn chi phí. Từ nghiên cứu của Wang et al (2003)
phát hiện đặc tính của hai gen hemolysin (aerolysin và hemolysin) có khả năng
gây bệnh của hai loài A. hydrophila và A. sorbia bằng phương pháp m-PCR. Năm
2007, Panangala et al đã công bố phương pháp m-PCR có thể xác định cùng lúc
cả ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá, đó là Flavobacterium columnare (504bp),
Edwardsiella ictaluri (407bp), và Aeromonas hydrophila (209bp). Điều này sẽ
góp phần tăng khả năng phát hiện bệnh trên đối tượng thuỷ sản nhằm giảm thiệt
hại tối thiểu cho người nuôi, đặc biệt là khi tốc độ tăng diện tích và mật độ nuôi
ngày càng tăng nhanh thì sự gia tăng mầm bệnh cũng tăng nhanh theo tỉ lệ thuận.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 11
PHẦN 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
 Địa điểm nghiên cứu: các phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh
Thủy sản - Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ.
 Thời gian thực hiện: từ tháng 01 đến tháng 05 năm 2008.
3.2 Vật liệu
3.2.1 Vật liệu nghiên cứu
 Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn,
 Đĩa petri, ống nghiệm,
 Ống đong, lame, lamella,
 Chai nấu môi trường, bình tam giác,
 Cá từ, pipet, đầu cole, ống hút, găng tay,
 Các vật liệu nghiên cứu khác, v.v….

 Môi trường thạch simon citrate (Merck) dùng để kiểm tra khả năng sử
dùng nguồn cacbon của vi khuẩn.
 Môi trường thạch dưỡng (NA-nutrient agar; Merck) + 0,5% starch (Merck)
dùng để kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột.
 Môi trường MR-VP (voges proskauer; Merck) dùng cho phản ứng VP.
 Môi trường nutrient broth (NB; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh
indole.
 Môi trường decarboxylase (Himedia) + yeast extract (Merck) + 1% acid
amin (arginine, lysine và ornithin) (Merck) dùng kiểm tra khả năng khử
amino acid.
 Môi trường 0,1% pepton (Himedia) + 0,2% KH
2
PO
4
(Merck) + 0,0012%
phenol red (Merck) + 0,1% glucose + 2% ure (Merck) dùng kiểm tra khả
năng sử dụng urea của vi khuẩn.
 Môi trường triple sugar iron (TSI; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh khí
H
2
S của vi khuẩn.
 Môi trường trypton broth (Merck) + 1% hay 3%, NaCl (Merck) dùng
kiểm tra khả năng chịu đựng ở các nồng độ muối.
Thuốc thử
 Dung dịch H
2
O
2
3% cho phản ứng catalase.
 Que thử Oxidase (Merck).

CAF134
CAF135
A.hydrophila LMG 2844
V402
V425
60
Lei.1.10.99
BSL3172000
69 (Tam 2L)
BSK
Ngân hàng gen Bỉ
CAF
CAF
CAF
CAF
CAF
CAF
CAF
3.3 Phương pháp nghiên cứu
Các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Phục hồi vi khuẩn: dùng que cấy lấy vi khuẩn cấy lên môi trường TSA. Đem ủ ở
28
o
C trong 18-24 giờ kiểm tra kết quả.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống
nghiệm chứa 5 ml NB đặt lên máy lắc 200 vòng/phút sau 18- 24 giờ. Kiểm tra kết
quả.
Mỗi chỉ tiêu kiểm tra sinh hóa được lặp lại 3 lần.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 14

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 15
3.3.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E
Kiểm tra các các phản ứng sinh lý và sinh hóa của A. hydrophila sử dụng bộ kít
API 20E của hãng BIO MÉRIEUX.
Các chỉ tiêu cơ bản (hình dạng, khả năng di động, osidase, catalase và phản ứng
O/F) được thực hiện trước khi sử dụng bộ kít API 20E.
Phương pháp thực hiện
 Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm trong quá trình ủ
trong tủ ấm.
 Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5ml nước muối sinh
lý tiệt trùng, lắc đều.
 Dùng pipet với đầu cole tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô
của bộ test.
 Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô ngoại trừ 3 ô CIT, VP và
GEL thì nhỏ đầy và 5 ô ADH, LDC, ODC, H
2
S và URE cho paraffin tiệt
trùng vào.
 Ủ trong tủ ấm ở 28
0
C và đọc kết quả sau 24 giờ.
Đọc kết quả
TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện cho phản ứng dương
(+), màu vàng cho phản ứng âm (-).
IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vòng màu đỏ xuất hiện cho
phản ứng dương (+), màu vàng cho phản ứng âm (-).
VP: Thêm một giọt mỗi dung dịch thuốc thử VP
1
, VP

SAC Xanh/xanh lá Vàng
MEL Xanh/xanh lá Vàng
AMY Xanh/xanh lá Vàng
ARA Xanh/xanh lá Vàng
Ghi chú: ONPG: ortho-nitrophenyl galactosidase; ADH: arginine dihydrolase; LDC:
lysine decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H
2
S: sinh H
2
S; Urea:
ure; TDA: tryptophane deaminase; IND: indole; VP: phản ứng Voges- Proskauer; GEL:
gelatin; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose;
SAC: sucrose; MEL: melibiose; AMY: amygdaline; ARA: arabinnose.
Mỗi chủng vi khuẩn được lặp lại ba lần.
3.3.3 Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp PCR
Chiết tách acid nucleic (Bartie et al, 2006)
 Nuôi tăng sinh vi khuẩn (16-18 giờ) trong 5ml LB.
 Rút 1,5ml dung dịch vi khuẩn và 100µl TE (10mM Tris HCl và 1mM
EDTA) vào ống eppendorf.
 Đun ở 95
0
C trong vòng 15 phút.
 Làm lạnh trong nước đá.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 17
 Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút. Rút phần dung dịch cho vào ống
eppendorf mới (trữ ở -20 ºC nếu chưa sử dụng). Đo hàm lượng DNA
(OD=260nm).
Khuyếch đại DNA (theo Panangala et al (2007) có chỉnh sửa)
Thành phần cho phản ứng

0
C trong 30 giây, giai đoạn gắn
mồi 52
0
C trong 45 giây, giai đoạn kéo dài chuỗi 72
0
C trong 30 giây.
Tổng hợp cuối ở 72
o
C trong 7 phút.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 18 30 chu kỳ 95
0
C 95
0
C

4’:00 0’:30 72
0
C 72
0
C