Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN
NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU
SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E
T
Ố
Ố
Ố
T
T
T
N
N
N
G
G
G
H
H
H
I
I
I
Ệ
Ệ
Ệ
P
P
P
N
G
G
G
À
À
À
N
N
N
H
H
H
N
N
N
U
U
U
Ô
Ô
Ô
I
I
I
Y
S
S
S
Ả
Ả
Ả
N
N
N
C
C
C
H
H
H
U
U
U
Y
Y
Y
Ê
Ê
Ệ
N
N
N
H
H
H
H
H
H
Ọ
Ọ
Ọ
C
C
C
T
T
T
H
H
H
Ủ
Ủ
NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU
SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E
L
L
L
U
U
U
Ậ
N
N
N
G
G
G
H
H
H
I
I
I
Ệ
Ệ
Ệ
P
P
P
Đ
Đ
Đ
Ạ
Ạ
Ạ
I
N
N
H
H
H
N
N
N
U
U
U
Ô
Ô
Ô
I
I
I
T
T
T
R
R
R
Ồ
Ả
Ả
N
N
N
C
C
C
H
H
H
U
U
U
Y
Y
Y
Ê
Ê
Ê
N
N
N
N
H
H
H
Ọ
Ọ
Ọ
C
C
C
T
T
T
H
H
H
Ủ
Ủ
Ủ
Y
Y
Y
S
Được làm luận văn tốt nghiệp là mong muốn của rất nhiều sinh viên, trong đó có
bản thân tôi. Tuy nhiên để có thể hoàn thành luận văn này là cả một quá trình phấn
đấu, phải mất nhiều thời gian và công sức để nghiên cứu, đồng thời phải được sự
hướng dẫn nhiệt tình của thầy cô.
Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa thủy sản trường Đại Học
Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn sinh học và bệnh thủy sản đã truyền đạt
những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong thời gian tôi theo học và nghiên
cứu tại trường.
Xin cám ơn gia đình đã động viên giúp đỡ không chỉ về vật chất mà cả về tinh thần
từ khi tôi bước chân vào trường.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị
Tiên đã tận tình giúp đỡ trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Xin gởi lời cám ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng và thầy Đoàn Nhật Phương đã
nhiệt tình quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập.
Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến tập thể lớp nuôi trồng và bệnh học thủy sản K30
đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
Chương I : Giới thiệu 1
Chương II: Lược khảo tài liệu 3
2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá 3
2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh trên cá tra ở ĐBSCL 3
2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá da trơn 4
2.31. Bệnh xuất huyết 4
2.3.2 Bệnh mủ gan trên cá tra 5
2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp 8
Chương III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 11
3.1 Thời gian và địa điểm 11
3.1.1 Thời gian 11
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
v
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 13
Bảng 3.2: Bảng test các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn 14
Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định
bằng bộ kít API 20E 15
Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR 16
Bảng 4.5: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng
vi bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 19
Bảng 4.6: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng
vi bằng bộ kit API 20E 22
Long (ĐBSCL) có nhiều điều kiện tự nhiên thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản
phát triển. Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản đã đóng góp đáng kể
vào kim ngạch xuất khẩu ở Việt Nam, tạo công ăn, việc làm, tăng thu nhập,
xóa đói giảm nghèo cho các vùng nông thôn. Nổi bật là nghề nuôi cá tra do
đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon, có khả năng thích ứng
cao với điều kiện môi trường khắc nghiệt. Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở
ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất
khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước
(www.fistenet.gov.vn)
Tuy nhiên khi diện tích nuôi được mở rộng, nghề nuôi được thâm canh hóa
nhất là nuôi với mật độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và
gây thiệt hại cũng nhiều hơn. Có thể nói trong những năm gần đây nghề nuôi
thủy sản đang phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ do sự suy
thoái về môi trường và lây lan của mầm bệnh. Trong đó bệnh truyền nhiễm mà
nhất là bệnh vi khuẩn đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và
sản lượng cá nuôi với sự nổi bật là bệnh mủ gan đã gây thiệt hại không nhỏ về
kinh tế cho nhiều hộ nuôi. Các kết quả nghiên cứu gần đây xác định bệnh mủ
gan là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh xảy ra trên cá tra nuôi ở
tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và
ctv, 2003).
Hiện nay phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên
cá tra phổ biến là phương pháp sinh hóa sử dụng phương pháp kiểm tra xác
định đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E. Tuy
nhiên, chưa có những thông tin về sự đồng nhất hay sai khác khi xác định đặc
tính sinh lý và sinh hóa của hai phương pháp này khi định danh vi khuẩn E.
ictaluri. Đề tài “Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa
giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được xác định bằng phương
pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E” được thực hiện
nhằm tìm ra những chỉ tiêu sinh hóa giống và khác nhau khi sử dụng hai
phương pháp nêu trên, góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3
CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá
Bệnh cá được bắt đầu nghiên cứu từ cuối thế kỷ XIX nhưng cơ bản vẫn mô tả
các dấu hiệu lâm sàng. Sang đầu thế ký XX các nhà khoa học thế giới đã bắt
đầu nghiên cứu các triệu chứng cũng như tác nhân gây bệnh trên cá. Năm
1904, Bruno Hofer người Đức đã viết cuốn sách “Father of fish Pathology”
(Bùi Quang Tề, 2006).
Viện sĩ V.A. Dogiel thuộc viện hàn lâm khoa học Liên Xô cũ là người có
công lớn khi viết phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng trên cá (1929), mở
đầu cho việc nghiên cứu ký sinh trùng trên cá. Năm 1939 ông cũng cho xuất
bản quyển “Bacterial Disease of Fish”. Những năm 1930 bệnh truyền nhiễm
của cá đã được nghiên cứu trong các phòng thí nghiệm. Năm 1949 nhà khoa
học người Liên Xô E. M. Lyaiman cho xuất bản sách giáo khoa về bệnh cá
(Bùi Quang Tề, 2006).
Kết quả nghiên cứu các tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản đến nay rất
phong phú, bệnh virút của cá đến nay đã phân loại được hơn 60 loại virút
thuộc 5 họ có cấu trúc ADN hoặc ARN (Bùi Quang Tề, 2006). Ở Việt Nam bộ
môn bệnh cá được Hà Ký thành lập năm 1960. Sau đó được đưa vào giảng dạy
trong các trường đại học. Từ cuối năm 1960 trở lại đây hàng loạt nghiên cứu
mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận, nấm, thối mang. Trong đó 3 bệnh là
gan có mủ, đốm đỏ và ký sinh trùng xảy ra với tần suất cao nhất.
Kết quả này cũng phù hợp với điều tra của Nguyễn Chính (2005) là tình hình
bệnh trên cá tra nhìn chung chưa thấy phát sinh bệnh mới mặc dù tỉ lệ cảm
nhiễm và cường độ cảm nhiễm ngày càng cao hơn.
2.3 Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá da trơn
2.3.1 Bệnh xuất huyết
Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh xuất huyết được phân lập đầu tiên trên cá nheo
Mỹ bởi Hawke (1979). Năm 1999, Austin đã phát hiện ra vi khuẩn này gây
bệnh nhiễm trùng máu cấp tính (enteric septicemia of catfish - ESC) trên cá
nheo mỹ, gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá nheo (Hawke và
ctv,1998).
Plumb, 1999 cho biết bệnh do vi khuẩn E. ictaluri xảy ra trên cá trơn vào mùa
có nhiệt độ thấp. Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa xuân
đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu khi nhiệt độ nước khoảng 18 - 28C.
Theo mô tả của Inglis và ctv (1993), khi cá bị bệnh trên đầu xuất hiện những
vết loét, cá bơi lờ đờ trên mặt nước, bơi xoay tròn với tư thế đầu trên đuôi
dưới, sưng tấy ở da, miệng, nắp mang và bụng, phù mắt. Bên trong xoang
bụng có chất dịch màu vàng, thận và tỳ tạng sưng to, quan sát mô và các cơ
quan có hiện tượng xuất huyết, đặc biệt là có những đốm trắng ở gan. Bệnh
này bên cạnh xuất hiện trên cá nheo nuôi ở miền Đông Nam Mỹ, thì bệnh
cũng được tìm thấy ở Indiana, Idaho, California, Arizona và New Mexico.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
5
Ngoài cá nheo, các loài blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish
(Ictalurus melas) cũng nhạy cảm với E. ictaluri (Plumb và Sanchez, 1983) và
theo ghi nhận của Kasornchandra và ctv (1987) thì vi khuẩn này cũng được
tìm thấy trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan.
Hawke và ctv (1998) mô tả đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri là loài vi khuẩn
xuất hiện đầu tiên ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An
Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận.
Đặc biệt những năm gần đây bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển
nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng. Tỷ lệ hao hụt lớn ở cá giống
nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá có trọng lượng từ 300-
500g.
Nguyễn Quốc Thịnh (2002) kết luận khi cá bị bệnh mủ gan biểu hiện bên
ngoài không có gì đặc biệt, một số có hiện tượng xuất huyết ở các vi, có khi
xuất huyết toàn thân, khi giải phẫu và quan sát nội tạng thấy có nhiều đốm
trắng trên gan, thận và tỳ tạng. Thêm vào đó, trong xoang bụng có chứa dịch
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
6
hơi đặc. Khi cấy những đốm trắng lên môi trường agar sau 24 - 48 giờ thấy
xuất hiện các khuẩn lạc rất thuần.
Tác nhân gây bệnh mủ gan được xác định là Edwardsiella ictaluri (Từ
Thanh Dung và ctv, 2005)
Mùa vụ xuất hiện và mức độ gây thiệt hại: Bệnh mủ gan thường xuất hiện
vào mùa lũ, cao điểm vào tháng 7, 8. Tuy nhiên trong hai năm gần đây bệnh
này xuất hiện trên cá tra hầu như quanh năm. Trong 1 vụ nuôi bệnh mủ gan có
thể xuất hiện 3-4 lần. Tỉ lệ hao hụt lên đến 10-15%, tùy thuộc vào chế độ
chăm sóc và quản lý (Từ Thanh Dung và ctv, 2005)
Dấu hiệu bệnh lý
Cá bị bệnh không có những dấu hiệu bệnh lý bất thường, ở giai đoạn mới
chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi nhưng giảm ăn. Một số trường hợp cá có biểu
hiện gầy, bơi lờ đờ da nhợt nhạt có biểu hiện xuất huyết trên da và hậu môn.
Dấu hiệu bệnh lý đặt thù nhất là bên trong nội quan các cơ quan gan, thận, tỳ
tạng xuất hiện những đốm trắng đường kính 1-3 mm, các cơ quan này sưng to
và có biểu hiện nhũng ở thận (Ferguson và ctv, 2001)
Kết quả nghiên cứu mô bệnh học cá tra bị bệnh trắng gan của Nguyễn Quốc
8
CFU/ml nhận thấy có 93% cá nheo bị nhiễm và biểu
hiện bệnh ESC (trích dẫn bởi Plumb, 1999).
Năm 1993, để kiểm tra đường xâm nhập của vi khuẩn E. ictaluri vào hệ tiêu
hóa cá, Baldwin và Newton tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên
140 cá nheo mỹ (khoảng 8-10 tháng tuổi) bằng phương pháp đưa vi khuẩn vào
hệ tiêu hóa với mật độ 1x10
9
CFU/ml. Kết quả tại thời điểm 0,25 giờ đã tìm
thấy vi khuẩn ở thận trước.
Hai nhà khoa học là Williams và Laurence (2005) đã sử dụng phương pháp
tiêm vi khuẩn E. ictaluri so sánh với phương pháp ngâm trên cá nheo Mỹ ở
các mật độ tăng dần. Đối với E. ictaluri R4383 WT (dùng phương pháp tiêm)
với mật độ 5,2x10
3
CFU/ml, 5,2x10
4
CFU/ml, 5,2x10
5
CFU/ml thì tỷ lệ cá chết
lần lượt là 67,2%, 100% và 100%. Trong khi đó E. ictaluri R4383 WT (dùng
phương pháp ngâm) với mật độ 5,7x10
3
CFU/ml,
5,7x10
4
CFU/ml, 5,7x10
5
CFU/ml, 5,7x10
6
, 1x10
7
CFU/ml (phương pháp ngâm) và 10
4
, 10
5
và 10
6
CFU/ml (phương pháp tiêm),
theo dõi tỷ lệ cá chết trong thời gian 10 ngày thì thấy cso sự biến đổi về mặt
cấu trúc ở các mô thận, gan, tỳ tạng là nhiều nhất.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
8
Phương pháp sinh hóa truyền thống: Sinh hóa truyền thống là phương pháp
có từ rất lâu đời, được ứng dụng nhiều trong thủy sản và mang lại kết quả to
lớn, định danh thành công các loài vi khuẩn trong môi trường nước, góp phần
vào việc nghiên cứu, tìm ra tác nhân gây bệnh. Không phải tác giả nào cũng
đưa ra các chỉ tiêu giống nhau để định danh vi khuẩn, chẳng hạn chỉ tiêu này
là quan trọng cho loài này nhưng lại không cần thiết cho loài khác, nhưng nhìn
chung tất cả đều dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản. Người ta chia vi khuẩn thành
các nhóm khác nhau, nhóm vi khuẩn gram âm và gram dương, nhóm di động
hay không di động mà từ đó có hướng đi khác nhau cho từng loài vi khuẩn.
Việc định danh vi khuẩn dùng sơ đồ gia phả đã được áp dụng bởi nhiều tác
giả, và định danh ra các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio, Edwardsiella,
Aeromonas…. Năm 2004, Buller dùng phương pháp định danh truyền thống
với 41 chỉ tiêu cho các chủng E. ictaluri để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh
hóa. Tương tự, thì Plumb và ctv (1983) cũng đã dùng test sinh hóa truyền
cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
c. Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 72C, đó là điều kiện tốt nhất
để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc
bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho ADN polymerase hoạt
động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuyếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được
nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn
cho chu kỳ nhân bản tiếp theo. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được
tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2
n
bản
ADN từ một khuôn ban đầu.
Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc
phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virút, ký sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh
thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm: virút
đốm trắng (WSSV), virút đầu vàng (YHV), virút gây hoại tử cơ quan tạo máu
và cơ quan tạo lập biểu mô (IHHNV), virút gây hội chứng Taura (TSV) (Đặng
Thị Hoàng Oanh, 2007).
Phương pháp phức hợp PCR (multiplex PCR - mPCR) là một dạng biến hóa
của PCR. Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều loại bệnh,
giúp tiết kiệm công sức lẫn chi phí xét nghiệm.
Đối với virút đặc biệt là virút trên tôm, mPCR đã có những bước phát triển
mới phát hiện nhiều loại bệnh cùng lúc, đem lại các kết quả chẩn đoán nhanh,
chính xác, tiết kiệm nhiều thời gian và công sức. Cụ thể Yang và ctv (2006),
đã phát triển phương pháp m-PCR phát hiện đồng thời hai loại virút IHHNV
và WSSV trên tôm he. Với đoạn mồi I 2814, I 3516 và W1, W2 lần lượt cho
hai loại bệnh trên với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR lần lượt là 703
và 824 bp.
Wongteerasupaya và ctv (1998) đã phát triển phương pháp mRT- PCR phát
CHƯƠNG III
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian
Từ tháng 01/2008 đến 05/2008.
3.1.2 Địa điểm
- Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản Khoa Thủy sản -
Trường Đại học Cần Thơ.
- Phòng thí nghiệm gây cảm nhiễm Khoa Thủy sản, trường Đại Học Cần
Thơ.
3.2 Nội dung thực hiện
- Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1
- Nuôi tăng sinh vi khuẩn.
- Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống.
- Định danh vi khuẩn bằng kit API 20E.
- Dùng phương pháp PCR khẳng định kết quả định danh.
- Tiến hành thí nghiệm gây cảm nhiễm, tái phân lập và tái định danh vi
khuẩn.
3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
3.3.1 Vật liệu
Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn,
Đĩa petri, ống nghiệm,
Ống đong, lame, lamella,
Chai nấu môi trường, bình tam giác,
Cá từ, pipet, đầu cone, ống hút, găng tay,
Các vật liệu nghiên cứu khác, v.v….
3.3.2 Thiết bị
Kính hiển vi,
Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy,
amino acid.
Môi trường 0.1% pepton (Himedia) + 0.2% KH
2
PO
4
(Merck) +
0.0012% phenol red (Merck) +0.1% glucose + 2% ure (Merck) dùng
kiểm tra khả năng sử dụng urea của vi khuẩn.
Môi trường TSI (triple sugar iron; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh
khí H
2
S của vi khuẩn.
Thuốc thử
Dung dịch oxy già H
2
O
2
3% cho phản ứng catalase.
Que thử Oxidase (Merck).
Đĩa ONPG (Ortho-nitrophenyl galactosidase; Merck)
Thuốc thử Kovac’s (Merck) cho phản ứng sinh indole.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
13
Thuốc thử Lugol’s Iodine (cách pha được trình bày ở phần Phụ lục) cho
khả năng thủy phân tinh bột (starch).
Thuốc thử cho phản ứng VP.
Các dung dịch nhuộm Gram.
Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR
LB (10g tryptone, 5g yeast extract và 5g sodium chloride, trong 1L
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
14
3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
- Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cấy lên môi trường TSA, ghi nhận
kết quả phục hồi của vi khuẩn sau 24-48 giờ ở 28 C.
- Chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đặt
trên máy lắc sau 24 - 48 giờ kiểm tra kết quả.
3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống
Hình dạng, kích thước tính ròng và các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn được
xác định bằng phương pháp của Barrow và Feltham (1993).
Các chỉ tiêu sinh hóa được thực hiện cho phương pháp sinh hóa truyền thống
và sử dụng bộ kít API 20E được trình bày ở Bảng 3.2 và Bảng 3.3. Các chỉ
tiêu sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống được thực hiện lặp lại 3 lần,
kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất hai lần lặp lại. Cách tiến hành,
thành phần môi trường và cách pha chế được trình bày ở phụ lục 1.
Bảng 3.2 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn
được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống
STT Chỉ tiêu kiểm tra
1 Nhuộm Gram
2 Hình dạng
3 Tính di động
4 Oxidase
5 Catalase
6 O/F
7 ONPG
8 Arginine
9 Lysin
10 Ornithine
11 Khả năng sử dụng citrate
GEL và VP thì cho đầy, các ô còn lại cho vừa đủ.
- Cho paraffin tiệt trùng vào các ô ADH, LDC, ODC, H
2
S và URE.
- Ủ trong tủ ấm ở 28C và đọc kết quả sau 48 giờ.
Đọc kết quả
- TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện cho phản ứng
dương (+), màu vàng cho phản ứng âm (-).
- IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vòng màu đỏ xuất hiện
cho phản ứng dương (+), màu vàng cho phản ứng âm (-).
- VP: Thêm một giọt mỗi dung dịch thuốc thử VP
1
, VP
2
. Đợi ít nhất 10 phút,
màu hồng hoặc màu đỏ xuất hiện cho phản ứng dương (+). Nếu màu hồng
nhạt xuất hiện trong vòng 10-12 phút, được coi là phản ứng âm (-).
- Các chỉ tiêu còn lại đọc kết quả dựa vào bảng chỉ tiêu, không cần sử dụng
thuốc thử. Sau khi cho thuốc thử vào không nên đem ủ trở lại trong tủ ấm.
Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi
khuẩn được xác định bằng bộ kit API 20E
Chỉ tiêu Âm tính Dương tính
ONPG Không màu Vàng
ADH Vàng Đỏ/cam
LDC Vàng Đỏ/cam
ODC Vàng Đỏ/cam
CIT Vàng Xanh/xanh lá
H
2
S Không màu Đen
Đoạn mồi xuôi (EiFd-1): GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC
Đoạn mồi ngược (EiRs): GAACGCTATTAACGCTCACACC
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR
STT Thành phần tham gia phản ứng Hàm lượng
1 PCR Buffer 10 X
2 MgCl
2
1.5 mM
3 dNTPs 200 µM
4 Taq DNA polymerase 5 U
5 Đoạn mồi (EiFd-1) 0.4 µM
6 Đoạn mồi (EiFd-1) 0.4 µM
7 Mạch khuôn 20 ng
8 Nước cất -
- Chu kỳ nhiệt
1. Giai đoạn tiền biến tính: 95C trong 4 phút.
2. Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm:
- Giai đoạn biến tính: 95C trong 30 giây
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
17
- Giai đoạn gắn mồi: 53C trong 45 giây
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: 72C trong 30 giây.
3. Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng: 72C trong 10 phút.
Điện di
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa
1.5% agarose. Đun nóng dung dịch agarose tan hoàn toàn. Sau đó để dung
dịch nguội khoảng 50-60C cho ethidium bromide vào và đổ agarose vào
khay. Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel. Độ dày của gel
chỉ cần cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm và bề dày gel không quá
Copyright: Tài liệu đại học ©