TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

DƯƠNG VĂN NHÍ SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY
CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU


SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY
CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. PHẠM THANH LIÊM

2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
TÓM TẮT
Đề tài “Sự biến đổi các chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri có độc lực

khác nhau” nhằm xách sự biến động các chỉ tiêu huyết học
của cá tra giống khi cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
có LD
50
khác nhau. Đề tài được thực hiện trên ba chủng chủng T8, KSL 103,
CAF 258 với hai đối chứng (một đối chứng tiêm nước muối sinh lý và một đối
chứng không tiêm). Nồng độ vi khuẩn gây cảm nhiễm là liều gây chết 50%
tương ứng với từng chủng vi khuẩn, thời điểm thu mẫu được được định là thu
trước khi thí nghiệm,; thu lần 1 sau khi gây cảm nhiễm và lần 2 được thu sau
12 ngày cảm nhiễm. Hồng cầu được phân tích theo phương pháp của Natt and
Herrick, (1952), bạch cầu được phân tích theo phương pháp của Humason,
(1979), số liệu thống kê được sử lý bằng trương trình SPSS 16.0 (sử dụng
phép thử phép thử Ducan và phép thử LSD). Sau khi phân tích nhậ thấy: sự
biến động về số lượng tế bào hồng cầu giữa 3 chủng T8, KSL 103, CAF 258 là
giống nhau; Chủng T8 có tỷ lệ giảm số lượng TBC, lympho, tiểu cầu ít hơn,

2.3.3 Tiểu cầu 6
2.3.4 Bạch cầu đơn nhân 6
2.3.5. Bạch cầu trung tính 6
2.3.6 Một số nghiên cứu về huyết học trên cá 8
2.4 Một số kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong phòng
thí nghiệm 9
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1 Thời gian và địa điểm 11
3.2 Vật liệu nghiên cứu 12
3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 12
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 12
3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 12
3.3 Phương pháp nghiên cứu 12
3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể 12
3.3.2 Cách chuẩn bị dung dịch vi khuẩn 12
3.3.3 Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cá 13
3.3.4 Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm 14
3.3.5 Thời gian thu mẫu 14
3.4 Phương pháp phân tích mẫu 14
3.4.1 Phương pháp đếm hồng cầu (Natt and Herrick, 1952) 15
3.4.2 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu (Humason, 1979) 16
3.5 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri theo phương
pháp truyền thống 17
3.6 Xử lý số liệu 17
PHẦN 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 18
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

iv
4.1 Đặc điểm cá thí nghiệm 18
4.1.2 Đặc điểm bên ngoài 18
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.3 5. Tế bào máu 8
Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 14
Hình 3.4 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu 16
Hình 3.4.1 Buồng đếm hồng cầu 17
Hình 4.1 Hệ thống các bể bố trí thí nghiệm 18
Hình 4.1.3 Nội tạng cá tra bị nhiễm E. Ictaluri 19
Hình 4.2.1 Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 19
Hình 4.2.2 Kết quả test sinh hóa vi khuẩn E. Ictaluri 20
Hình 4.3.1.1a Hồng cầu cá khỏe 23
Hình 4.3.1.1bHồng cầu cá bệnh 23
Hình 4.3.1.2 Sự biến động số lượng hồng cầu qua các lần thu mẫu trong từng
chủng E.ictaluri 25
Hình 4.3.2.1 Sự biến động số lượng TBC qua các lần thu mẫu trong từng
chủng E.ictaluri 28

Bảng 4.3.2.2c Sự biến động số lượng bạch cầu trung tính (tế bào x 10
3
/mm
3
)
qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 30
Bảng 4.3.2.2d Sự biến động số lượng bạch cầu đơn nhân (tế bào x 10
3
/mm
3
)
qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluric 30
Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các
chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 1 31
Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các
chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 2 32
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

vi
TỪ VIẾT TẮT
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long
TGTM: Trắng gan, trắng mang
Tb: tế bào
BCTT: Bạch cầu trung tính
BCĐN: Bạch cầu đơn nhân
TBC: Tổng bạch cầu

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
PHẦN 1

mm bên trong chứa dịch màu trắng đục.
Cùng với việc xác định được tác nhân gây bệnh, từ trước đến nay đã có
nhiều chủng vi khuẩn được phân lập từ các ao nuôi cá bị bệnh mủ và gây cảm
nhiễm trở lại trong phòng thí nghiệm nhằm tìm hiểu khả năng gây bệnh, đặc
điểm sinh hóa, tìm hiểu độc lực…Tuy nhiên, vẫn chưa có chủng vi khuẩn nào
đã phân lập, được tìm hiểu về huyết học. Vì vậy đề tài “Sự biến đổi các chỉ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm
nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực

khác nhau”
được thực hiện.
1.2 Mục tiêu
Xác định sự biến động các chỉ tiêu huyết học của cá tra giống khi cảm
nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD
50
khác nhau
1.3 Nội dung thưc hiện
• Gây cảm nhiễm cho cá tra giống với các chủng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri có LD
50
khác nhau.
• Định loại và định lượng các tế bào máu trên cá tra cảm nhiễm.
• Tái phân lập và định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
bệnh mủ gan với tỷ lệ chết lên đến 80-90%, kế đến là những bệnh phù đầu, lồi
mắt, nổ mắt với tỷ lệ chết từ 60% đến 70%. Còn theo Từ Thanh Dung (2005)
thì tần xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản với vi khuẩn (50,9%), virut
(24,6%), kí sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%).
Theo Nguyễn Tấn Duy Phong (2008), bệnh xuất hiện quanh năm nhưng
chủ yếu tập trung vào tháng 5 đến tháng 9, đỉnh điểm là từ tháng 9 đến tháng
11 hàng năm. Một số bệnh xuất hiện với tần số cao như gan thận mủ (93,8%),
xuất huyết (75%), trắng gan trắng mang (68,8%).
2.2 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra
2.2.1 Sơ lược về lịch sử bệnh do E.ictaluri gây ra trên cá trơn
Vi khuẩn E.ictaluri được Hawke (1979) phân lập đầu tiên trên cá nheo
Mỹ. Đến năm 1981, Hawke và ctv. xác định vi khuẩn E.ictaluri là nguyên
nhân gây bệnh ESC (Enteric septiceamia catfish).
Vi khuẩn E.ictaluri có khả năng gây bệnh trên một số nhóm cá như
Blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish (Ictalurusrcatus) (Hawke,
1981), cá trê trắng (Clarias batrachus) (Plumb,1987).
Ở Việt Nam, bệnh do vi khuẩn E.ictaluri gây ra trên cá tra được gọi là
bệnh BNP (Bacillary necrosis of Pangasius)-mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu
tiên ở ĐBSCL cuối năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ (Ferguson et al., 2001). Bệnh gây hao hụt
rất lớn ở cá giống nhưng thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn vào khoảng 300-
500 g (Từ Thanh Dung và ctv, 2005), những mô tả về mô bệnh học đầu tiên
của bệnh này được thực hiện bởi Ferguson et al., (2001). Đến năm 2002,
Crumish et al. (2002), khẳng định rằng E.ictaluri là tác nhân chính gây bệnh
mủ gan trên cá tra nuôi ở ĐBSCL, thiệt hại do bệnh mủ gan gây lên đến 90% (
Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003), hơn nữa mầm bệnh diễn biến ngày càng
phức tạp và có chiều hướng gia tăng, theo Phạm Thanh Tuấn (2004) tần số
xuất hiện của bệnh là 43,3% sang năm 2005 là 82% (Nguyễn Chính, 2005)

giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi nhưng giảm ăn, một số trường
hợp cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ da nhợt nhạt, có biểu hiện xuất huyết trên
da và hậu môn. Dấu hiệu bệnh lý đặc thù nhất là bên trong nội quan các cơ
quan gan, thận,và tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng, đường kính 1- 3mm, các
cơ quan này sưng to và có biểu hiện nhũng thận (Ferguson et al., 2001).
Trên cá tra, E.ictaluri tấn công vào các cơ quan như thận, gan, tỳ tạng
(Ferguson, Từ Thanh Dung và ctv., 2001). Theo Lương Trần Thục Đoan
(2006), thì thận và tỳ tạng là 2 hai cơ quan mà vi khuẩn tấn công đầu tiên chứ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
không phải ở gan. Ngoài ra, khi thu mẫu ngoài thực tế cũng tìm thấy vi khuẩn
tại các cơ quan khác như: máu, não, cơ,mang, tim, bóng hơi. Trong đó, thận,
tỳ tạng, bóng hơi là những cơ quan bị nhiễm E.ictaluri cao.
Kết quả kiểm tra bằng phương pháp mô bệnh học quan sát thấy trên gan
xuất hiện nhiều vùng xung huyết động mạch và tĩnh mạch gan, mô gan bị hoại
tử và mất cấu trúc, từng cụm vi khuẩn xuất hiện ở rìa các vết thương ở gan cá
tra bị bệnh. Tương tự, ở thận cũng xung huyết và hoại tử, tỳ tạng xuất hiện
nhiều vùng ngoại tử trên các vết thương (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002; Trần Thị
Ngọc Hân, 2006), trong khi những biến đổi mô học nghiêm trọng được ghi
nhận trên cá nheo bệnh ESC là ở cơ quan thận và tỳ tạng, cả 2 cơ quan này
đều hoại tử, gan chỉ bị sưng (Areechon et al., 1983; trích dẫn từ Plumb, 1999).
2.3 Các chỉ tiêu huyết học
Máu cá là thành phần quan trọng trong hệ tuần hoàn của tất cả cơ thể
sống, là môi trường sinh lý của cơ thể. Chính vì vậy, các chỉ tiêu huyết học
của cá được nghiên cứu ngày càng nhiều và có liên quan đến vấn đề sức khỏe
của cá (Bhasker and Rao, 1995 trích dẫn bởi Yazlak, 2003). Máu cá gồm
những tế bào máu được lưu thông trong môi trường lỏng là huyết tương hay
dịch bạch huyết đối với động vật không xương sống. Máu có chức năng vận
chuyển oxi, cung cấp vật chất dinh dưỡng, bài tiết những sản phẩm từ mô và
các cơ quan ra ngoài cơ thể. Ngoài ra, máu có vai trò tạo ra sức hô hấp cho cá,

nhuộm với Giemsa, tế bào chất nhỏ không rõ ràng và thường bắt màu xanh
nhạt (Chinabut et al., 1991). Theo Phuong et al. (2007) chia tế bào lympho
trong máu cá trê lai thành 2 loại: tế bào lympho nhỏ có kích cở 3,92-5,00 µm
và, và tế bào lympho lớn có kích cở khoảng 5,09-8,77 µm và có số lượng lớn
nhất trong số tổng bạch cầu (17,55-108,37x10
3
tb/µL).
2.3.3 Tiểu cầu
Hình dạng thay đổi, có thể là hơi tròn, dài hoặc hơi thoi. Có vành mỏng
của tế bào chất bao quanh nhân. Tế bào chất có màu xanh nhạt khi nhuộm với
dung dịch Wright & Giemsa. Tiểu cầu tham gia vào quá trình đông máu trong
trường hợp bị tổn thương (Chinabut et al., 1991).
2.3.4 Bạch cầu đơn nhân
Bạch cầu đơn nhân là tế bào lớn nhất trong các dạng tế bào máu với
đường kính 10-14 µm, hình dạng không đều, chúng có tâm lệch, trong tế bào
chất tồn tại những không bào có nhiều kích thước khác nhau. Nhân bắt màu
xanh, tế bào chất bắt màu xanh nhạt. (Chinabut et al.,1991). Bạch cầu đơn
nhân chỉ tồn tại vài ngày trong vòng tuần hoàn máu, sau đó di chuyển xuyên
qua màng trong của mao mạch để liên kết với các mô và thực hiện chức năng
thực bào (Gartner & Hiatt, 1997). Chúng thực bào, hủy diệt những vật lạ (vi
khuẩn), những tế bào chết hoặc những tế bào già cỗi (như hồng cầu) và tham
gia vào quá trình trình diện kháng nguyên.
2.3.5. Bạch cầu trung tính
Tế bào lớn và tròn đường kính nhân 9-13 µm với số lượng lớn của
những hạt nhỏ trong tế bào chất màu xanh nhẹ hoặc hơi hồng. Nhân bắt màu
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
xanh đậm, chia hai thùy ở tế bào thành thục và dạng tròn thành thục và dạng
tròn lệch tâm ở dạng chưa trưởng thành (Chinabut et al., 1991). Ở động vật có
vú, bạch cầu trung tính là tế bào thực bào chính và xuất hiện nhanh tại vị trí

1,63 ± 0,12.10
6
tb/mm
3
), riêng tế bào lympho lại tăng. Ngoài ra, dưới điều
kiện stress do sự thay đổi giá trị của pH làm cho lượng bạch cầu giảm, tăng
A: Hồng cầu (erythrocyte) B: Bạch cầu đa nhân (granulocyte)
C: Bạch cầu đơn nhân (monocyte) D: Tiểu cầu (thrombocyte)
E: Lympho (lymphocyte) F: Lympho chưa trưởng thành
D
B A
E
C
F
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
lượng đường trong máu và tạo ra nhiều tế bào hồng cầu chưa trưởng thành ở 3
loài cá chép ấn độ (Jera et al., 2006).
Năm 2003, Harikrishnan et al. nghiên cứu huyết học của cá chép
(Cyprinus carpio) gây cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila, kết quả
cho thấy tế bào hồng cầu giảm, bạch cầu tăng so với đối chứng với giá trị lần
lượt là: 1,68 ± 0,12.10
6
tb/mm
3
, 3,6 ± 0,2.10
4
tb/mm
3
và 2.31 ± 0,16.10

6
tb/mm
3
. Kết quả cho thấy mật độ hồng cầu, tế
bào lympho và bạch cầu trung tính của cá nhỏ cao hơn cá lớn. Ngược lại, tổng
bạch cầu, tế bào monocyte và tiểu cầu thì thấp hơn cá lớn.
Ngoài ra, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu huyết học của cá tra bị trắng gan
trắng mang (TGTM) cho thấy hồng cầu ở cá bị TGTM nhẹ (4,25.10
5
tế
bào/mm
3
) hay nặng (1,04.10
5
tế bào/mm
3
) đều giảm hơn so với cá khỏe
(2,27.10
6
tế bào/mm
3
), mật độ bạch cầu ở cá không có biểu hiện TGTM tăng
hơn so với cá khỏe. Trong khi đó, mật độ bạch cầu của cá bị TGTM nhẹ
(3,27.10
4
tế bào/mm
3
), TGTM nặng (0,99.10
4
tế bào/mm

Tuy nhiên, theo Williams & Lawrence (2005) đã sử dụng vi khuẩn E.
ictaluri R4383 WT và R4383 HM với nồng độ lần lượt là 7,0 x 10
7
CFU/ml và
7,2x10
7
CFU/ml ngâm trên cá nheo Mỹ trong thời gian 30 phút, tỉ lệ chết là
90% và 85%. Đồng thời, tác giả cũng sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn E.
ictaluri để so sánh với phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn tăng dần. Đối
với vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT tiêm với mật độ 5,2x10
3
CFU/ml, 5,2x10
4

CFU/ml, 5,2x10
5
CFU/ml thì tỉ lệ chết lần lượt là 67,2%, 100%, 100%. Trong
khi đó, tiêm E. ictaluri R4383 HM với mật độ vi khuẩn là 5,2x10
3
CFU/ml,
5,2x10
4
CFU/ml, 5,2x10
5
CFU/ml và 5,2x10
6
CFU/ml gây chết 63,5%, 98,7%,
100%, 100%. Qua kết quả thí nghiệm, họ kết luận rằng không có sự khác nhau
giữa hai phương pháp ngâm và tiêm.
Thí nghiệm của Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) khi tiến hành ngâm vi khuẩn

KSL103 với giá trị LD
50
lần lượt là 4,7x10
2
CFU/ml; 1,3x10
4
CFU/ml và
2,1x10
4
CFU/ml, còn chủng A1 không xác định được LD
50
do ở nồng độ thấp
(10
3
) đã gây chết 100% số cá thí nghiệm. Qua đó cho thấy độc chủng CAF
258 khá mạnh, còn LD
50
chủng A1 dưới 10
3
. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
- Thời gian: tháng 01/2009 đến 06/2009.
- Địa điểm: Phòng cảm nhiễm, phòng thí nghiệm của Bộ môn sinh học
và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ.

• Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt, ống nghiệm, đĩa petri thủy tinh, micropipet
1ml, 5ml, hộp đầu col 1ml, 5ml, chai 100ml, 250ml, 500ml, lame, lamen,
đĩa Petri viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn, sổ ghi chép, kim tiêm 1ml, bộ
tiểu phẩu, ống nghiệm, buồng đếm hồng cầu
• Bể Composite (2m
3
), bể thí nghiệm (100L), máy bơm nước (cấp nước
cho hệ thống thí nghiệm), máy sục khí, ống sục khí, đá bọt, tủ ấm, nồi
thanh trùng, máy ly tâm, máy so màu quang phổ, máy trộn mẫu (vortex).
Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho nghiên cứu…
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn
• NaCl, Na
2
SO
4
, Na
2
HPO
4
.2.H
2
O, NaH
2
PO
4
.2H
2
O, KH

vệ sinh kỹ.
3.3.2 Cách chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường NA/TSA ở 28
0
C. Sau 24-48
giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần
của vi khuẩn.
Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que
cấy tiệt trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml
NB đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm
4000 vòng/phút ở 4
0
C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía
trên và dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm
Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng
25ml dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy
vortex. Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với
bước sóng 590nm và điều chỉnh OD tương ứng để xác định mật độ vi khuẩn.
OD=0,1±0,02 tương ướng mật độ vi khuẩn là 10
8
cfu/ml.
Tiến hành pha loãng dung dịch vi khuẩn với các mật độ tương ứng với

Thí nghiệm thực hiện trên 3 chủng Edwardsiella ictaluri có LD
50
khác
nhau. Đối với chủng T8 có giá trị LD
50
là 1,3x10
4
CFU/ml, còn chủng
CAF258 là 4,7x10
2
CFU/ml và 2,1x10
4
CFU/ml là giá trị LD
50
của chủng
KSL103. Thí nghiệm gồm hai đối chứng: Cá không tiêm dung dịch vi khuẩn;
cá được tiêm nước muối sinh lý 0,85 % . Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn
ngẫu nhiên và được lập lại 3 lần với các ngiệm thức sau:
• Nghiệm thức 1: Cá được tiêm dung dịch vi khuẩn ở nồng độ LD
50

chủng T8.
• Nghiệm thức 2: Cá được tiêm dung dịch ở nồng độ LD
50
chủng CAF
258.
• Nghiệm thức 3: Cá được tiêm dung dịch vi khuẩn ở nồng độ chủng
KSL 103.
Mỗi nghiệm thức được bố trí cá với mật độ 10 con/ xô nhựa (100L)
chứa khoảng 60 L nước, có bố trí sục khí (Hình 3.1). Mỗi cá thể được tiêm 0.1

(40X). Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 vùng đếm (vùng ký hiệu chữ
C), đưa vào giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X. Đếm 2 lần lặp lại.

Hình 3.4.1 Buồng đếm hồng cầu (Phuong et al., 2007)
Cách tính mật độ hồng cầu:
R = C x 10 x 5 x D (tb/mm
3
)
Trong đó: R: mật độ tế bào hồng cầu/ mm
3
.
C: là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm.
Lamelle

Lame

10X
40X

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
10: khoảng cách giữa lamella và buồng đếm (0,1 mm).
5: diện tích của 5 vùng đếm (0,2 mm
2
).
D: hệ số pha loãng (200).
3.4 2 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu (Humason, 1979)
v Nhuộm mẫu
Mẫu máu đã được cố định trên lame sẽ nhuộm bằng dung dịch nhuộm
Wright & Giemsa (Chinabut & ctv, 1991):

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17
3.5 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri theo
phương pháp truyền thống
Sự tái định danh của vi khuẩn sẽ được thực hiện thông qua phương pháp định
danh truyền thống được mô tả theo phương pháp chung của phòng thí nghiệm
Bệnh học thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần thơ.
v Các bước thực hiện
• Ghi nhận các dấu hiệu bên ngoài của cá.
• Giải phẩu cá ghi nhận biểu hiện của các cơ quan nội tạng.
• Phân lập vi khuẩn từ 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng lên môi trường
thạch TSA. Áp dụng các biện pháp vô trùng để tránh trường hợp bị
tạp nhiễm.
• Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 28-30
o
C. Sau 48 giờ quan sát và ghi
nhận hình thái của khuẩn lạc. Tiếp tục tách ròng, theo dõi để đạt đĩa
cấy thuần. Sau đó tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản về hình thái
(di động, gram, hình dạng), sinh lý (Oxidase, catalase, O/F) và một
số chỉ tiêu sinh hóa (Phụ lục A).
3.6 Xử lý số liệu
Số liệu sẽ được xử lý bằng phần mềm SPSS với mức ý nghĩa 0,05% ( phép thử
Ducan và phép thử LSD).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version