Luận văn tốt nghiệp
Sử dụng các dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens phòng
trừ vi khuẩn Ralstonia
solanacearum gây bệnh héo xanh
trên cây cà chua
phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum, giúp cây cà chua sinh trưởng và phát
triển tốt hơn, làm cho tác nhân gây bệnh không kháng thuốc, an toàn với môi
trường sinh thái cho kết quả nhanh và chính xác rất phù hợp với xu hướng nông
nghiệp an toàn hiện nay và đang được rất nhiều nước trên thế giới áp dụng.
Việc nghiên cứu các loại vi khuẩn đối kháng như : Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, để chống lại vi khuẩn Ralstonia
solanacearum là một vấn đề hết sức cần thiết hiện nay. Vì vậy, nghiên cứu về tính
đa dạng của các cá thể trong quần thể vi khuẩn gây bệnh và sự lưu hành của chúng
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
2
ở các vùng sản xuất là rất cần thiết, nó làm cơ sở khoa học cho các giải pháp phòng
chống và chọn tạo giống kháng bệnh sau này.
Xuất phát từ thực tiễn trên và để đánh giá khả năng phòng trừ của các dòng
vi khuẩn Pseudomonas fluorescens. Chúng tôi thực hiện đề tài:
“Sử dụng các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phòng trừ vi
khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua”.
1.2 Mục đích – yêu cầu
Đánh giá khả năng phòng trừ của các dòng vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên
cây cà chua.
1.3 Giới hạn đề tài
Đề tài được thực hiện trong tháng có nhiều mưa, đất trồng bò nhiễm nhiều
loại bệnh. Cây cà chua là loại cây dễ mẫn cảm với nhiều loại bệnh.
1.4 Đối tượng nghiên cứu
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
4
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Lòch sử nghiên cứu bệnh
Vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại
trên 200 loài cây cỏ. Halted đã nghiên cứu bệnh này vào năm 1892, năm 1896
E.F.Smith nghiên cứu, mô tả, đònh tên Pseudomonas solanacearum. Những năm sau
đó, bệnh héo rũ được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu, nghiên cứu một cách
toàn diện như Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Baker 1983, Yabuuchi 1992,
1995(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998).
Bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua có tên là:
Southern wilt (theo cách gọi của người Hoa Kỳ), Bacterial wilt (theo cách gọi của
người Anh), ở Việt Nam gọi là bệnh héo xanh, héo rũ.
1991).
Ở Đài Loan bệnh được gây hại trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, cà tím,
đậu phụng, dâu tây, tía tô, thầu dầu, mè, củ cải, rau dền và một số cây trồng khác.
Trên nhiều loại cây trồng sự thiệt hại do bệnh gây ra có thể từ 5-100% năng suất.
Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum chủ yếu thuộc race1 (Yung-An Lee,
2001).
Ở Ai Cập, bệnh héo xanh vi khuẩn do Ralstonia solanacearum được ghi nhận
là gây hại nặng nhất trên cà chua và a ti sô trong những năm gần đây, sự thiệt hại
gây ra trên a ti sô từ 5-20% năng suất (Aly, 2000).
2.3 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum có dạng hình gậy, hai đầu hơi tròn, có một
lông roi ở một đầu, kích thướt 0,5-1,5µ
,
nhuộm gram âm là loài vi sinh vật tồn tại ở
trong đất thường xuyên gây ra các bệnh chết héo (héo rũ, héo xanh) trên nhiều loại
cây trồng như lạc, khoai tây, cà chua, ớt, thuốc lá phổ biến rộng ở hầu hết khắp các
vùng, gây tác hại lớn cho sản xuất. Chúng lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vào
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
6
cây qua các vết thương và di chuyển vào trong bó mạch. Bệnh thường xảy ra vào
lúc cây đang tăng trưởng.
Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ tương đối cao, đất ẩm, xâm nhập qua vết
thương, sinh sản ở các bó mạch, kí chủ và di chuyển ở các bó mạch từ thân đến lá,
sinh độc tố làm cây héo, chết.
Phá bó mạch làm tắt ngẽn sự vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng, bệnh
hại nhiều trên đất cát pha, đất thòt bệnh nhẹ hơn. Trên những ruộng trồng luân canh
với cây lúa nước bệnh nhẹ.
tồn nhiều năm trong đất, ngược lại race 3 thường có xu hướng giảm sau vài năm
nếu không có khoai tây dại làm ký chủ.
2.4.2 Biovar
Dựa vào đặc tính sinh lý, sinh hoá khác nhau của các mẫu phân lập, 5
biovar có thể nhận dạng dựa vào khả năng sử dụng và oxi hoá 3 disaccharides
(cellobiose, lactose, maltose) và 3 rượu 6 cacbon (dulcitol, mannitol, sorbitol).
Biovar 2 thường bao gồm race 3, biovar 5 gồm race 4 và biovar 1, 3, 5 gồm race 1.
2.5 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Triệu chứng thường biểu hiện ngay sau khi bệnh xâm nhập vào cây. Ở cây
bò bệnh ban ngày lá mất màu nhẵn bóng, tái xanh, héo cụp xuống, ở giai đoạn cây
con thường biểu hiện trên toàn cây còn ở giai đoạn cây trưởng thành triệu chứng
thường biểu hiện ở lá ngọn trước. Ở 1-2 ngày đầu cây có thể phục hồi lại được vào
lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau 2-3 ngày lá héo không thể hồi phục lại được
nữa và toàn cây bò héo rũ rồi chết. Cắt ngang đoạn thân cây gần mặt đất ta thấy bó
mạch bò hoá nâu, trong điều kiện ẩm độ cao thân cây bò bệnh dần dần thối mềm, ấn
mạnh gần miệng cắt có thể thấy dòch nhờn vi khuẩn tiết ra màu trắng sữa. Rễ có
màu nâu đen và thối.
2.6 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh
Thời gian vi khuẩn lưu tồn trong đất phụ thuộc nhiều yếu tố như ẩm độ,
nhiệt độ, hoá lý đất. Bên cạnh đó còn phụ thuộc vào race gây bệnh, race 1 thường
lưu tồn lâu trong đất trái lại race 3 thường giảm sau vài năm do khả năng thích ứng
thấp hơn. Vi khuẩn có thể lưu tồn trong đất từ 5-6 năm, trong cơ thể ký chủ thực vật
hoặc trong hạt giống có thể sống tới 7 tháng, còn nếu bám dính trên bề mặt hạt chỉ
tồn tại 2-7 ngày (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998).
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
9
trường và sức khỏe con người một cách nghiêm trọng. Dùng formol, Mocap 10G,
Furadan 3H, vôi, CuSO
4
xử lý đất. Dùng thuốc: Kasuran, Rovral, Dithan.
2.7.2 Biện pháp sinh học
Khi sử dụng thuốc hoá học để bảo vệ thực vật thì thuốc sẽ tạo thành một lớp
mỏng trên bề mặt lá, quả, thân cây, mặt đất, mặt nước và một lớp chất lắng gọi là
dư lượng ban đầu của thuốc vì vậy biện pháp sinh học trong công tác bảo vệ thực
vật ngày càng chú ý khai thác và vò trí của biện pháp nay ngày càng được nâng
cao. Việc bảo vệ môi trường sống, môi trường sản xuất cũng như tiến hành nông
nghiệp sạch thì biện pháp này càng có ý nghóa hơn.
Sử dụng một số vi khuẩn đối kháng như Bacillus sudtilis, Pseudomonas
fluorescens để xử lí hạt trước khi gieo, nhúng rể cây con trước khi trồng hoặc đưa vi
sinh vật đối kháng vào vùng rễ sau trồng nhằm ức chế, cạnh tranh và tiêu diệt vi
khuẩn Ralstonia solanacearum (Đỗ Tấn Dũng, 2001).
Sử dụng chế phẩm V
58
có chứa vi sinh vật đối kháng trên ruộng trồng cà
chua ở Tiền Phong - Mê Linh - Vónh Phúc, kết quả thu được có công thức sử dùng
V
58
tỉ lệ chết giảm còn 25% so với đối chứng 80% (Lê Như Kiểu, 2001).
Ngoài ra, chúng ta cần phải làm đất vườn ươm sạch bệnh, cày bừa kỹ, bón
đạm vừa phải, phân chuồng phải ủ hoai, luân canh với cây lúa nước và dùng thuốc
một cách hợp lý.
2.8 Phòng trừ sinh học bệnh cây
2.8.1 Khái niệm phòng trừ sinh học bệnh cây
bệnh và vi sinh vật đối kháng, phương pháp có liên quan đến cây kí chủ.
2.8.3 Vi khuẩn - một tác nhân phòng trừ sinh học:
Nhiều công trình nghiên cứu về các tác nhân phòng trừ sinh học đã công bố
từ dầu thế kỷ 20 trong đó có vi khuẩn. Đang là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
11
biến nhất là Pseudomonas spp., kế đến là Bacillus spp. và Streptomyces (Burr và
ctv, 1978, Weller và Cook, 1983).
Những nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn trên thân lá cây đã dẫn
đến việc chia chúng thành ba loại: loại có hại cho cây, loại trung tính và loại có ích
cho cây. nh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do chúng sản sinh ra chất kích
thích tăng trưởng cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hoặc cả
hai (Baker, 1988). Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh là tiết ra các chất
kháng sinh (Fravell, 1988). Tuy nhiên những yếu tố khác như việc tiết ra chất
sidrophores, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng có vai trò quan trọng trong việc
ức chế tác nhân gây bệnh (Cook và Baker, 1983).
Trong số các loài Pseudomonas spp., Pseudomonas fluorescens được chú ý
và tăng cường nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại nấm
bệnh lưu tồn trong đất, loài vi khuẩn này có khả năng kích thích sự phát triển cây
trồng. Bằng cách xử lý hạt có hay không có chất mang hoạt chủng vào đất cùng với
giá thể làm thức ăn nền, đã làm giảm mức trầm trọng cũa bệnh, làm gia tăng sự
phát triển và tăng năng suất cây trồng. Với thuận lợi là có nhiều cơ chế tác dụng
như: đònh cư, chiếm chỗ, loại trừ mầm bệnh ra khỏi vùng thích hợp, tiết chất kháng
sinh (Pyrrolnitrin, pyoluteorin) ngoại ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng (hợp chất sắt),
gia tăng sức đề kháng cho cây, Pseudomonas rất có triển vọng sử dụng trên lãnh
vực thương mại.
Biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều khiển môi trường, cây
gây bệnh trong điều kiện In vitro và trong nhà lưới VKĐK đã khống chế được bệnh
do nấm
Sclerotium rolfsii
gây ra.
Phạm Mỹ Liên, 2004 nghiên cứu về vấn đề “Chọn lọc và đánh giá dòng vi
khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh trên
cây cà chua” cũng đã thành công trong quá trình nghiên cứu.
2.8.4.2 Nghiên cứu ngoài nước
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
13
Tại Đài Loan, bằng phương pháp PCR với cặp primer PS-IS đặc hiệu với vi
khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc race 1, kết quả phân tích cho thấy tất cả các
dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
thu thập trên cà chua, khoai tây, ớt, đậu phộng,
cà tím, thuốc lá, dâu tây, chuối và nhiều loại cây trồng khác đều thuộc race 1 (Yang
An Lee, 2001).
Phân tích trên 120 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên cà
chua, khoai tây, cà tím, ớt, chuối, gừng và nhiều loại cây trồng khác từ Châu ,
Mỹ, u, Phi và Châu Đại Dương cho thấy vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
thuộc
division Châu thường bao gồm biovar 3 và 4, division Châu Mỹ thường bao gồm
biovar 1 và 2.
Theo Rindran và Vidhiaekaran (1996) cho rằng những loại vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens được phân lập từ vùng rễ, có sắc tố phát huỳnh quang
vàng xanh cũng kìm hãm sự phát triển của nấm
Đề tài được thực hiện từ ngày 5/6/2005 – 30/8/2005
3.1.2 Đòa điểm
- Nơi tiến hành nghiên cứu: Công ty Hai Mũi Tên Đỏ thuộc công ty giống
Đông Tây, xã Nhuận Đức, huyện Củ Chi, Thành Phố Hồ Chí Minh.
- Nơi phân lập và nuôi cấy: Phòng thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ
Thực Vật – Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
15
- Nơi phân tích: Trung tâm phân tích thí nghiệm hoá sinh – Trường Đại học
Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối
kháng: 18, 73, 85, 123, 124, 187 và các dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
gây
bệnh: RST004, RST005, RST006, RST01, RSBog3, RSBog4. Hạt cà chua với tỷ lệ
nẩy mầm 90%.
Môi trường phân lập và nuôi cấy:
- PDA (potato, dextrose, agar)
- LB (tryptone, yeast extract, sodium chloride)
- WA (water, agar)
Vật liệu lây nhiễm: hạt giống cà chua (1628)
3.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đóa
petri trong phòng thí nghiệm
3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà
chua trong nhà lưới
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhà lưới tại công ty Hai Mũi Tên
Đỏ.
Vật liệu nghiên cứu:
- Nguồn vi khuẩn kháng mạnh nhất và gây độc mạnh nhất được chọn lọc
trong phòng thí nghiệm.
- Hạt cà chua với tỉ lệ nảy mầm 90%.
- Đất.
- Chậu nhựa 7x12cm (đường kính x chiều cao).
- Khay xốp (60 lổ).
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
17
- Trang thiết bò thí nghiệm tại phòng thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ
Thực Vật và tại trung tâm phân tích thí nghiệm Hoá Sinh trường Đại học Nông Lâm
Tp.Hồ Chí Minh.
Môi trường sử dụng: LB lỏng (tryptone, yeast extract, sodium chloride).
Phương pháp tiến hành: Lây nhiễm theo phương pháp của Phạm Đăng Minh
(2003) có cải tiến
- Sau khi khảo sát tính độc của các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum
trong phòng thí nghiệm, ta chọn ra các dòng gây độc cho cây cà chua và chọn ra
một dòng mạnh nhất. Tương tự, ta cũng chọn ra một dòng VKĐK mạnh nhất.
- Nguồn vi khuẩn: từ nguồn vi khuẩn trữ ở -80
0
C, nuôi cấy trên môi trường
LB lỏng khoảng 16 giờ, ly tâm thu vi khuẩn ở 3000 vòng/phút, hoà vi khuẩn vào
nước cất vô trùng.
): chỉ xử lý vi khuẩn gây bệnh trong ly đất.
NT3 (T
3
): xử lý vi khuẩn đối kháng ở giai đoạn hạt nứt nanh và vi khuẩn gây
bệnh trong ly đất.
NT4 (T
4
): xử lý vi khuẩn đối kháng ở giai đoạn hạt nứt nanh, trước khi trồng
vào ly đất đã chủng sẵn vi khuẩn gây bệnh tiến hành nhúng cây cà chua vào dòch vi
khuẩn đối kháng đã chuẩn bò sẵn với mật số 10
9
cfu/ml, (khoảng 20 phút).
3.2.4 Phương pháp đánh giá tính độc của vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
trên
cây cà chua trong điều kiện nhà lưới
Các phương pháp đánh giá giống như mục 3.2.3 nhưng chủng vi khuẩn gây
độc với mật số vi khuẩn: 10
10
cfu/g đất, tiến hành theo dõi trong 12 ngày sau trồng.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ chết của cây cà chua (%)
3.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens
với dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
trên cây cà
chua ngoài đồng ruộng.
Thí nghiệm được tiến hành ngoài đồng ruộng tại công ty Hai Mũi Tên Đỏ. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
T
1
’
T
2
’
T
2
’
T
1
’
T
2
’
T
2
’
T
1
’
Ghi chú:
T
4.1 Mức đối kháng của các dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens
với các
dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
trên đóa petri
Trên đóa petri có chứa môi trường PDA dùng que tran vi khuẩn tran đều 6
dòng VKGB, sau đó tiến hành cấy thành 5 điểm đã đánh dấu trước tương ứng với 5
dòng VKĐK để xác đònh mức độ đối kháng của 5 dòng vi khuẩn. Kết quả được tình
bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1 Mức độ đối kháng của 5 dòng vi khuẩn trên đóa petri
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
21
DVKGB
DVKĐK
RST004 RST005 RST006 RST01 RSBog3 RSBog4
18 +++ +++ +++ +++ +++ ++
73 +++ ++ +++ +++ +++ +++
85 +++ +++ +++ +++ +++ +++
123 ++ + + ++ + +
124 ++ ++ + ++ + +
Chú thích:
(+++): kháng mạnh
(++): kháng trung bình
(+): kháng yếu
DVKGB: dòng vi khuẩn gây bệnh
DVKĐK: dòng vi khuẩn đối kháng
Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: RST004, RST005, RST006,
24
Hình 4.5: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RST005 Hình 4.6: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RST006
Copyright: Tài liệu đại học ©