Luận văn

Công nghệ tổng hợp
Lysine

ii

Mục lục
Danh mục hình iv
Danh mục bảng vi
Danh mục đồ thị viii
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1
1. 1.Giới thiệu về lysine 1
1.1.1. Khái niệm 1
1.1.2. Cấu tạo 1
1.1.3. Vai trò và ứng dụng 2
1.1.4. Các dạng tồn tại của lysine 4
1.2. Các phương pháp thu nhận lysine 8
1.2.1. Phương pháp thủy phân 8
1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học 9
1.2.3. Phương pháp lên men 9
1.2.4. Phương pháp kết hợp 9
1.3. Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật 11
1.3.1. Sơ đồ chuyển hóa 11
1.3.2. Thuyết minh các giai đoạn chuyển hóa 13
1.5. Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum 19
1.5.1. Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum 19
1.5.2. Bộ gen của Corynebacterium glutamicum 20

2.1.3. Các nghiên cứu về đối tượng sản xuất lysine là Corynebacterium
glutamicum 59
2.2. Công nghệ lên men L-lysine 78
2.2.1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L-lysine 78
2.2.2. Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế
phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine 85
2.2.3. Nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine ở các chế độ lên men khác
nhau 88
2.2.4. Nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-lysine 90
2.2.5. Nghiên cứu tổng hợp lysine bằng tế bào cố định 96
CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN 100
Tài liệu tham khảo 101

iv Danh mục hình
Hình 1. 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine 2
Hình 1. 2 Cấu trúc không gian của L-lysine. 2
Hình 1. 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành
phần của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật . 3
Hình 1. 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua . 4
Hình 1. 5 L-lysine sulphate . 4
Hình 1. 6 L-lysine HCl 5
Hình 1. 7 Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 6
Hình 1. 8 Sản phẩm thương 6
Hình 1. 9 Sản phẩm thương 7
Hình 1. 10 Sản phẩm thương mại 7
Hình 1. 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct. 8
Hình 1. 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder 8

Bảng 1. 4 Các plasmid nội sinh của Corynebacterium được sử dụng trong việc thiết kế
vector . 28
Bảng 1. 5 Ảnh hưởng của số lượng bản sao dapA khác nhau trên tốc độ tăng trưởng,
sự bài tiết L-lysine . 35

Bảng 2. 1 Các chủng vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic hoang dại theo báo cáo như là
chủng bố mẹ để sản xuất các amino acid và như là gen chủ cho nhân dòng . 60
Bảng 2. 2 Kết quả thu được từ sáu chủng đột biến ở điều kiện lên men thu 61
Bảng 2. 3 Hiệu quả của gen ddh trong C. glutamicum 70
Bảng 2. 4 Cách sử dụng codon của gen ddh . 71
Bảng 2. 5 Giống C. glutamicum dùng trong bài nghiên cứu này . 73
Bảng 2. 6 Vị trí chuỗi primer đặc biệt được sử dụng phổ biến để thay thế trong G.
glutamicum bằng phương pháp PCR và chuỗi DNA tiếp theo sau . 73
Bảng 2. 7 Sản lượng và những đặc trưng của sự sản xuất lysine của 75
Bảng 2. 8 Sinh khối và các chất chuyển hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr
77
Bảng 2. 9 Nhu cầu đồng hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp 78
Bảng 2. 10 Khả năng lên men của chủng CM24 trên 4 loại môi trường. 79
Bảng 2. 11 Ảnh hưởng của pH lên sản lượng L-lysine qui mô 50 lít. 80
Bảng 2. 12 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít. 81
Bảng 2. 13 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít. 82
Bảng 2. 14 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 1500 lít. 83
Bảng 2. 15 Hiệu suất thu hồi L-lysine. 83
Bảng 2. 16 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%).
87
vii

Bảng 2. 17 Sản lượng L-lysine thu được bằng các phương pháp lên men khác nhau. . 89
Bảng 2. 18 Ảnh hưởng của hàm lượng đường giới hạn lên năng suất và sản lượng L-
lysine. 89

Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu
1 CHƯƠNG I : TỔNG QUAN
1. 1.Giới thiệu về lysine:
1.1.1. Khái niệm:
Lysine là một α-amino acid thiết yếu con người không thể tổng hợp được.
Lysine chứa hai nhóm (-NH
2
) và một nhóm (-COOH). Trong cấu tạo phân
tử lysine có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học:
D-lysine và L-lysine. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau,
chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và
một sang trái làm tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác và cơ thể sinh vật
sống chỉ hấp thu được lysine dạng L.
Lysine tồn tại dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân hủy
ở nhiệt độ 200-300°C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrin [38].
Lysine là một trong 9 amino acid không thay thế trong tổng số 20 amino acid, tìm
thấy trong cấu trúc của những phân tử protein tự nhiên của tất cả sinh vật sống và
được tổng hợp từ vi sinh vật. Lysine thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con
đường phân nhánh.
Lysine là acid amin rất cần thiết cho hoạt động sống của người và động vật.
Nhu cầu lysine trên thế giới năm 2006 là 950,000-1000,000 tấn.
1.1.2. Cấu tạo:
Công thức phân tử: C
6
H
14
N

1.1.3. Vai trò và ứng dụng:
Lysine giữ vai trò sống còn trong tổng hợp protein, là chìa khóa trong sản
xuất enzyme, hoocmon và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng,
chống bệnh tật đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mụn gộp môi
hay mụn gộp sinh dục.
Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ không hoạt động bình
thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn, trí
tuệ phát triển kém. Chính vì thế lysine thường được đưa vào phần ăn của trẻ và của
gia súc.
L-lysine là một amino acid cần thiết và đòi hỏi phải luôn có sẵn trong thức
ăn để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của động vật, đặc biệt đối với thức ăn từ ngũ
cốc, lúa mì hoặc lúa mạch thì nghèo lysine. Do đó bổ sung nguồn giàu lysine vào là
D
-
l
ysine

L
-
L
l
ysine

Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu
3

cần thiết để tăng hiệu quả thức ăn. Ta có thể bổ sung bột đậu nành (chứa nhiều
lysine) hoặc thêm trực tiếp lysine vào thức ăn. Ưu điểm của việc bổ sung trực tiếp
lysine là các amino acid không thay thế khác không được thêm vào nên thành phần
của chúng trong cơ thể không bị thay đổi. Ví dụ thêm 0.5% lysine tăng chất lượng

Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu
5

Các acid amin : 10% min.
Độ ẩm : 3% max
Muối amoni (như NH4) : 1% ma
Kim loại nặng : 0,003% max
Arsen : 0,0002% max.
Lysine Sulphate có thể được bổ sung vào L-lysine HCl làm thức ăn cho vật nuôi,
chúng có hiệu quả như L-lysine HCl.
 L-lysine HCl (L-Lysine monohydrochoride) [18].
Xuất xứ : Trung Quốc
Hình thức : Màu nâu sáng.

Hình 1. 6 L-lysine HCl [18].
Thành phần : ≥ 98.5%
Ẩm : £1%
Amonium (NH4) : 0.04%
Kim loại nặng : £ 0.003%
pH (1 :10 nước) : 5 - 6.09 Hình 2.5: L-lysine HCl
L-lysine HCL 98.5% (Feed Grade) là một trong những amino acid được sử dụng
rộng rãi nhất. Đây là amino acid cần thiết yêu cầu có trong chế độ ăn của lợn, gà vịt
gia cầm. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu
6

1.1.5. Các sản phẩm lysine thương mại:
 L-lysine với B6 [37].

hóa canxi, nó đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành collagen, một chất
quan trọng cho xương và mô liên kết bao gồm da, gân và sụn.
Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu
8 Hình 1. 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct [40].
 Lysine Powder [40]

Hình 1. 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder [40].
Thành phần L-Lysine.
1.2. Các phương pháp thu nhận lysine:[2]
1.2.1. Phương pháp thủy phân:
Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều
protein.
Các phương pháp này hiện nay vẫn đang được sử dụng rộng rãi.Tuy nhiên, phương
pháp này có nhược điểm là:
Thiết bị phải chịu được acid hay kiềm.
Trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều acid amin dạng D.
Trường hợp sử dụng acid để thủy phân sẽ ô nhiễm môi trường không khí do
lượng acid dư bay hơi trong quá trình thủy phân.
Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu
9

Giá thành thường cao.
1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học:
Ưu điểm của phương pháp là sản xuất ổn định, có thể tiêu chuẩn hóa điều
kiện sản xuất, đảm bảo hiệu suất nhưng nhược điểm là thu được các acid amin
dạng Racemic( L và D- acid amin) mà cơ thể không sử dụng dạng D nên công đọan
tách ra rất phức tạp.

phân
Dùng acid hoặc kiềm
để thủy phân tinh bột
chứa protein.
- Sử dụng rộng rãi do
phản ứng nhanh và triệt
để.
- Dễ điều khiển và kiểm
soát.
- Sản phẩm ít tạp chất.
- Cần thiết bị chịu
acid hay kiềm.
-Tạo ra nhiều lysine
dạng D khi thủy
phân bằng kiềm.
- Dùng acid gây ô
nhiễm môi trường.
- Giá thành cao.
Phương
pháp hóa
học
Dùng hóa chất để
tổng hợp nên lysine.
- Phản ứng nhanh.
- Dễ thực hiện.
- Sản phẩm ít tạp chất.
- Cho ra raxemic
(hỗn hợpL-lysine
và D-lysine)_tốn
kém khi tách.

ngược lại tế bào
làm giảm hiệu suất
phản ứng.
Phương
pháp
- Kết hợp giữa con
đường hóa học và
- Rút ngắn được thời
gian lên men.
- Con đường hóa
học có thể gây ô
Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu
11

kết hợp hóa
học và sinh
học
sinh học.
- Con đường hóa học
thu nhận được hợp
chất dạng L-keto và
các tiền chất của
lysine, sau đó sử dụng
vi sinh vật để chuyển
hóa những chất này
thành lysine.
- Tạo ra các hợp chất
trung gian kích thích sự
sinh amino acid của tế
bào nhiều.

xuất lysine.
Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu
14

Vào những năm trước 1969, Ozaki và Shiio đã khảo sát các quy luật của
phosphoenolpyruvate carboxylase và pyruvate kinase trong Brevibacterium
lactofermentum để tìm hiểu điểm phân nhánh của quá trình chuyển hóa glucose.
Tăng cường các phosphoenolpyruvate carboxylase thì thấy có thể kích thích sự tạo
thành acid aspartic thu được nhiều acid amin trong Brevibacterium
lactofermentum. Sau đó, người ta có thể thấy trong Corynebacterium glutamicum,
phosphoenolpyruvate carboxylase thì không cần thiết cho tăng trưởng và việc sản
xuất lysine. Điều đó cho thấy rõ ràng là đã có phản ứng phục hồi khác phải chịu
trách nhiệm bổ sung các nguồn oxaloacetate. Nổi bật nhất là pyruvate carboxylase,
một enzyme xúc tác sự chuyển đổi pyruvate và CO
2
tạo ra oxaloacetate dưới sự
thủy phân của ATP. Hình 1. 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate và Malate [34].
Khi oxaloacetate được sử dụng để làm tiền chất tổng hợp aspartate thì để
giúp cơ thể giữ được cân bằng của chu trình ATC, oxaloacetate đã được bù đắp
bằng một số phản ứng phục hồi (hình 1.15). Trong đó chủ yếu có sự tham gia của
các enzyme xúc tác phản ứng gắn CO
2
sử dụng vitamin biotin làm coenzyme. Đó
là các phản ứng gắn CO
2
lên pyruvate, phosphoenolpyruvate (PEP) tạo thành
Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu


chung là Aspartate-β- semialdehyde. Điều khiển quá trình tổng hợp lysine ở tế bào
vi khuẩn ta có thể chia ra thành 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Giai đoạn tạo ra oxaloacetate (tiền chất để tổng hợp aspartate):
Để tổng hợp lysine thì phải cung cấp nguồn nguyên liệu giàu glucose ( hoặc các
nguyên liệu cung cấp nguồn cacbon khác nhưng hiệu suất chuyển hóa giảm). Từ
glucose, tế bào vi khuẩn thực hiện chuyển hóa theo con đường EMP ( chu trình
đường phân) tạo ra fructose 1,6-diphosphate và chất này sẽ tiếp tục chuyển hóa tạo
thành pyruvic (pyruvate). Một phần piruvate bị oxy hóa tạo ra Acetyl-CoA- tiền
chất của chu trình Krebs tạo ra năng lượng cho tế bào, một phần pyruvat chuyển
hóa tạo ra oxaloacetate-tiền chất của họ aspartate. Aspartate là cơ chất cung cấp
toàn bộ nguồn cacbon cho lysine. Do đó, để tổng hợp nhiều lysine thì nguồn
aspartat phải đủ và ổn định. Vì vậy, một trong những hướng để cải tạo giống sản
xuất nhiều lysine là ta có thể điều khiển quá trình tổng hợp oxaloacetate theo các
cơ chế như đã trình bày phía trên.
Giai đoạn 2: Quá trình sinh tổng hợp lysine từ aspartate: Từ aspartate qua
các phản ứng tạo ra Aspartate-β- semialdehyde, tại đây thì con đường chuyển hóa
chia làm 2 nhánh. Một nhánh đi theo con đường tổng hợp ra homoserin tạo ra các
amino acid khác như methionine, threonine, isoluenine, một nhánh tổng hợp ra
lysine. Quá trình này được thực hiện với sự tham gia của nhiều enzyme trong đó
enzyme xem như là enzyme chìa khóa quyết định hiệu suất thu nhận lysine là
aspatokinase, aspartate semildehydedehydrogenase và Dihydrodipicolinate
synthase. Do đó để sản xuất lysine ta có thể điều khiển ba enzyme này. Ngoài ra ở
hình 1.16, ta thấy để rút ngắn con đường chuyển hoá tạo sản phẩm lysine ta có thể
điều khiển enzyme diamino pimelatedehydrogenase để từ piperideine-2,6-
dicarboxylate tạo ra diaminopimelate. Bên cạnh đó ta có thể điều khiển hoạt động
của enzyme permease để kiểm soát lượng lysine tiết ra ngoài (Hình 1.16).