CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN
GENE Ở ĐỘNG VẬT
THÀNH VIÊN NHÓM 7:
1.THÁI MINH TÂM
2.THÁI VIẾT HIẾU
3.DƯƠNG THỊ THANH BÌNH
4.PHẠM ĐÌNH THẢO
GVHD:
TS. NGUYỄN VĂN DUY
I. KHÁI QUÁT CHUNG:
1. KHÁI NIỆM:
- Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều
gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế
bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmix tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào
chủ. Trong tế bào chủ,các gen này hoạt động tổng hợp
nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các
đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.
- Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen
được xem là thành công khi gen chuyển vào được tổ hợp
vào genome của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp
được duy trì ổn định qua các thế hệ con cháu.
2. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN:

-
1977 Gurdon chuyển mRNA và DNA vào phôi Xenopus
(ếch) và quan sát thấy biểu hiện chức năng của chúng
-
1980 Brinster và cộng sự nhận được kết quả tương tự
ở chuột

+ Tế bào tinh trùng.
+ Mô phôi ở giai đoạn sớm.
+ Tế bào gốc phôi.
II. CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENE:
Gồm các bước cơ bản sau:
-
Tách chiết, phân lập gene mong muốn.
-
Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật.
-
Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene.
-
Biến nạp gene tạo phôi đông vật.
-
Nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử ( đối với ĐV bậc cao).
-
Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gene
lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gene gốc một cách liên
tục.
-
Sản xuất động vật chuyển gene.
Bước 1: Tách chiết, phân lập gene mong muốn:
-
Gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào
vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập
và tinh chế(tạo dòng).
-
Công cụ sử dụng để tạo dòng:
+ Enzyme cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase).
+ Các mẫu dò (probe).

(primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn.
Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển
Dạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon và intron
xuất hiện một cách tự nhiên. Các đoạn intron liên quan
đến việc cắt ghép mRNA và biểu hiện của gen. Dạng cDNA
là một trình tự chỉ bao gồm các đoạn exon mã hoá
protein của gen.
Bước 2 : Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật:
-
Các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các
loài khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống
nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase.
-
Bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận
biết các enzyme hạn chế khác nhau
-
Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có
vai trò điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều
hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà
ở gần đầu 5’ của gen là promoter, có vai trò quyết định
trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen.
SƠ ĐỒ CẤU TRÚC BIỂU HIỆN GENE
Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động
vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin,
amylase, insulin, ß-lactoglobulin, adiposite P2 hoặc từ
virus động vật như Simian virus(SV40),Rous sarcoma virus
(RSV)
Enhancer: gen tăng cường ATG: vị trí khởi đầu phiên mã
SIG: trình tự tín hiệu AAA: đuôi polyA
Bước 3:Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen

bào được xử lý nhỏ do phải thao tác trên từng tế bào.
-
Thường được dùng để đưa DNA vào hợp tử hoặc các tế
bào phôi sớm.
-
Chuyển gene vào tinh trung hoặc trứng khi đã thụ tinh
nhưng chưa kết hợp thành hợp tử lưỡng bội.
-
Việc chuyển gene chỉ thành công khi gene chuyển vào di
truyền cho các thế hệ sau.
Qui trình:
-
Thiết kế cấu trúc gene chuyển, lựa chọn gene thích hợp và tạo dòng.
-
Thu nhận trứng đã thu tinh
-
Chuẩn bị dung dịch DNA cho vi tiêm, nồng độ từ 1-5 µm/ml
-
Chuẩn bị tế bào hợp tử
-
Vi tiêm DNA vào tiền nhân
-
Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận
-
Kiểm tra gene chuyển ở con non. Lai tạo để củng cố di truyền.

b. Chuyển gene nhờ xung điện:
Nguyên tắc:
-
Khi trong điện trường có một mật độ tế bào cao và tạo ra một xung điện ( điện

glycoprotein, vỏ trong là lipide
kép, vỏ trong cùng là capside.
+ Phần lõi RNA gồm 2 sợi đồng
dạng và các enzyme.
+ Enzyme phiên mã ngược ( reverse
Transcriptase ), enzyme cài xen
( integrase ) giúp cho quá trình
cài xen bộ gene của virus với
genome tế bào vật chủ ở những
điểm tương đồng.

2. Cơ chế hoạt động của vector:
-
RNA của virus được loại bỏ các gene gag, pol,
env và thay vào đó là gene cần chuyển.
-
Vector retrovirus được đưa vào tế bào vật chủ
bằng nhiều phương pháp khác nhau.
-
Khi vào trong tế bào chất thì phần vỏ của
vector bị phân hủy, giải phóng RNA.
-
Enzyme phiên mã ngược xúc tác RNA 
cDNA  vào trong nhân tế bào  enzyme cài
xen giúp gắn cDNA vào genome tế bào vật chủ
 các sản phẩm protein của gene mục tiêu
trong tế bào đích.
Bước 5: nuôi cấy phôi trong ống nghiệm
Tế bào trứng tiền nhân  phôi dâu ( morula ) hoặc túi phôi ( blastocyst )  cấy
chuyền vào con nhận được gây chữa giả.