CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

1
Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ môn Công nghệ sinh học
Lớp DH06SH Bài tiểu luận: KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU
CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG
PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH
TIÊU CHẢY Giáo viên hướng dẫn:
Nguyễn Ngọc Hải

2. Vật liệu
2.1. Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn
2.2. Sinh phẩm, hoá chất, dụng cụ và máy móc dùng trong PCR
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Độ nhạy của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân.
a.Qui trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân
b. Xác định độ nhạy của hệ thống PCR đa mồi
3.2. Độ đặc hiệ
u của PCR đa mồi
3.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm PCR
4. Xử lý số liệu
IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Xác định độ nhạy của PCR đa mồi
CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

3
2. Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồi
V. BÀN LUẬN
1. Độ nhạy của PCR đa mồi
2. Xác định độ đặc hiệu của hệ thống PCR đa mồi
VI. KẾT LUẬN
- Độ nhạy
- Độ đặc hiệu
VII. Tài liệu tham khảo

chảy trong một năm đối với một trẻ từ 2,2 - 6 lần. Tại các nước công nghiệp
phát triển, tiêu chảy vẫn còn phổ biến ở trẻ em và người già. Có nhiều nguyên
nhân dẫn đến tiêu chảy, trong
đó vi khuẩn đóng vai trò quan trọng.Tiêu chảy
còn là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dưỡng, ảnh hưởng đến sự tăng
trưởng và phát triển của trẻ. Salmonella là một vi khuẩn có phạm vi lây lan
rộng, sống trong ruột của chim, loài bò sát và động vật có vú. Nó có thể lây
sang người qua nhiều loại thức ăn từ động vật. Những bệnh do chúng gây ra
(salmonellosis) tiêu biểu gồm sốt, tiêu chảy và đau bụng. Ở những người có
sức khỏe kém hay hệ
miễn dịch suy yếu, nó có thể xâm nhập vào máu và gây
ra những bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm. Salmonella là một căn nguyên gây
tiêu chảy đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu. Salmonella có thể gây bệnh
cho người, động vật hoặc cả cho người và động vật. Một số loài Salmonella
CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

5
hay gây bệnh thường gặp là S. typhi, chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên
gây bệnh thương hàn quan trọng nhất. S. paratyphi A, chỉ gây bệnh cho người,
là căn nguyên gây bệnh thương hàn, tỷ lệ ở nước ta đứng sau S. typhi. S.
paratyphi B, chủ yếu gây bệnh ở người. Tại các nước châu Âu, tỷ lệ vi khuẩn
này cao hơn ở Việt Nam. S. paratyphi C, vừa có khả năng gây bệnh thương
hàn vừa có khả nă
ng gây viêm dạ dày-ruột và nhiễm khuẩn huyết. Thường gặp
ở các nước Đông Nam Châu Á. S. typhimurium và S.enteritidis vừa có khả
năng gây bệnh cho người vừa có khả năng gây bệnh cho động vật. Chúng là
nguyên nhân chủ yếu của bệnh nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn do
Salmonella. S. choleraesuis là căn nguyên thường gặp trong nhiễm khuẩn
huyết do Salmonella ở nước ta.
II. Tổng quan tài liệu:

2
S (-), indol (-
).
Tuy nhiên không phải bất kỳ loài nào cũng có đầy đủ các tính chất trên.
Những ngoại lệ đã được xác định cần phải biết là: S.typhi lên men đường
glucose không sinh hơi và citrat Simmon (-). Trong loài S.paratyphi A chỉ có Salmonella phát triển trên thạch máu
Salmonella quan sát
dưới kính hiển vi
CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

7
một số chủng sinh H
2
S và ở loài này kết quả thử citrat Simmon (-),
lysindecarboxylase (-). S.arizona lên men lactose (tuy có chậm) và onPG (-). Salmonella trên thạch McConkey Salmonella sp. sau 24h trên thạch XLD
B. Phân loại: salmonella được phân loại theo 2 cách chính như sau:
• Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào:
- Giới : Bacteria
- Ngành: Proteobacteria
- Lớp: Gramma Proteobacteria
- Bộ: Enterobacteriales
- Họ: Enterobacteriaceae
- Giống: Salmonella lignieres 1900
- Loài: S. bongori & S. enterica

salmonella:
Salmonella có thể được chuẩn
đoán theo các phương pháp sau:
• Phương pháp phân lập
• Phương pháp miễn dịch
• Huyết thanh học
• ELISA
• Miễn dịch huỳnh quang
CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

9
• Phương pháp phân tử
• PCR
• Realtime PCR
• Multiplex PCR
Phương pháp kinh điển xác định các Salmonella trong các trường hợp
chúng gây bệnh tiêu chảy (đặc biệt trong thương hàn) là cấy máu và/hoặc cấy
phân. Phương pháp định danh kinh điển sử dụng các tính chất sinh vật hóa học
và ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu. Đã có một số nghiên cứu sử
dụng kỹ thuậ
t sinh học phân tử như lai DNA, phản ứng khuyếch đại gen -
Polymerase Chain Reaction (PCR).
- PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic trong ống nghiệm. Trong đó,
một đoạn ADN được nhân lên đặc hiệu. Trong kỹ thuật này, hai đoạn
oligonucleotid gắn đặc hiệu vào đoạn ADN đích và được khuếch đại theo
một số chu kỳ được lặp đi lặp lại. Chu kỳ này gồm việc làm tách hai sợi
của đ
oạn ADN, gắn hai oligonucleotid vào hai sợi này theo nguyên tắc bổ
sung và kéo dài đoạn oligonucleotid dưới tác động của enzym ADN
polymerase. Các oligonucleotid được gọi là "mồi" (primer) này gắn vào

Thành phần 1 PCR 6 - 8 PCR PCR đa
mồi
Tiết kiệm
Nước cất 11,1 ml 66,6 ml 6,3 ml 60,3 ml
Ðệm 2,0 ml 12,0 ml 2,0 ml 10,0 ml
dNTPs 1,6 ml 9,6 ml 1,6 ml 8,0 ml
MgCl
2
1,6 ml 9,6 ml 1,6 ml 8,0 ml
Mồi 1,6 ml 9,6 ml 6,4 ml 3,2 ml
Taq polymerase 0,1 ml 0,6 ml 0,1 ml 0,5 ml
DNA mẫu 2,0 ml 12,0 ml 2,0 ml 10,0 ml
Thể tích 20,0 ml 120,0 ml 20,0 ml 100,0 ml
Qua bảng trên chúng ta thấy, kỹ thuật PCR đa mồi cho phép tiết kiệm
thời gian và nguyên vật liệu (khoảng 5 lần) so với chạy riêng rẽ từng PCR để
chẩn đoán các vi khuẩn gây tiêu chảy.

III. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu
- Chủng Salmonella typhi VCMM2, 5 chủng Salmonella typhi (phân
lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân), Citrobacter freundii, Proteus vulgaris,
Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, E. coli ATCC 11775 và 5 chủng E.
coli ATCC gây tiêu chảy (EAEC, EHEC, EIEC, EPEC, và ETEC). Các chủng
CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

12
này (trừ 5 chủng S. typhi từ bệnh nhân) do Đề án Lưu giữ nguồn gen Vi sinh
vật Y học, Bộ môn Vi sinh vật, Đại học Y Hà Nội cung cấp.
2. Vật liệu
2.1. Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn

trong 10 phút để lắng các thành phần có kích cỡ trung bình. Lấy nước nổi.
- Bước 4: Nước nổi từ bước 3 được ly tâm tiếp với tốc độ 4000 vòng/phút
trong 10 phút để lắng vi khuẩn. Loại bỏ nước nổi và lấy cặn.
- Bước 5: Hoà tan cặn với 500 µl nước cất, trộn đều trên máy lắc. Ly tâm với
tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút.
Lặp lại quá trình rửa cặn này 1-2 lần
đến khi nước nổi không còn màu vàng
của phân. Loại bỏ nước nổi
- Bước 6: Hoà tan cặn thu được ở bước 5 vào 300 ml nước cất. Đun sôi cách
thuỷ 100
0
C trong 20 phút.
Sau khi đun làm lạnh ngay bằng cách cho ống Eppendorf vào khay đựng đá
vụn.
- Bước 7: Ly tâm lạnh 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ cặn. Nước nổi
chứa ADN dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR. Nếu chưa dùng ngay,
nước nổi được bảo quản ở -20
0
C.
b. Xác định độ nhạy của hệ thống PCR đa mồi
- Pha chủng Salmonella typhi vào 1 ml nước cất để có độ đục
Macfarland 4.
- Pha loãng 10 lần các huyền dịch chứa 10
9
vi khuẩn/ml này để có các
nồng độ từ 10
9
, 10
8
đến 10

phương pháp tách chiết bằng bộ kít QIAamp DNA Stool Mini Kit của hãng
QIAGEN (Đức).
3.2. Độ đặc hiệu của PCR đa mồi
- Pha lần lượt các chủng Citrobacter freundii, Proteus vulgaris,
Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, chủng E. coli ATCC 11775, 5
chủng E. coli gây tiêu chảy vào 1 ml nước cất để có
độ đục Macfarland 4
(tương đương với 10
9
vi khuẩn/ml).
- Các huyền dịch chứa 10
9
vi khuẩn/ml được pha loãng 10 lần để có các
nồng độ từ 10
9
, 10
8
đến 10
1
, 10
0
vi khuẩn/ml.
- Trộn 1 ml từng huyền dịch vi khuẩn trên với 200 mg phân đã được
xác định không có Salmonella.
- Tách chiết DNA theo qui trình ở trên.
- Tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi với DNA thu được sau khi tách chiết.
- Độ đặc hiệu được xác định là tỷ lệ các chủng Âm tính với PCR đa
mồi trên tổng số các chủng được thử. So sánh với phương pháp tách chiết
bằng bộ kít QIAamp DNA Stool Mini Kit của hãng QIAGEN (Đức).
3.3. Đánh giá chất l

2. Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồi
Độ đặc hiệu được xác định là tỷ lệ các chủng Âm tính với PCR đa mồi
trên tổng số các chủng được thử.
Bảng 3. Độ đặc hiệu của PCR đa mồi Nhận xét Kết quả ở bảng 3 cho thấy, PCR đa mồi với các vi khuẩn
đường ruột khác đều âm tính. Điều đó chứng tỏ độ đặc hiệu của hệ thống PCR
đa mồi bằng 100%.
V. BÀN LUẬN
1. Độ nhạy của PCR đa mồi
- Hiện nay, PCR được đánh giá là một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc
hiệu rất cao, gần 100%. Kỹ thu
ật có được độ nhạy và độ đặc hiệu cao là do
PCR sử dụng cặp mồi gắn đặc hiệu vào đoạn ADN đích.
- Tuy nhiên, khi thực hiện kỹ thuật PCR, người ta thấy rằng độ nhạy
của phản ứng này cũng chính là giới hạn phát hiện của phản ứng. Giới hạn này
chính là nồng độ của đoạn ADN đích trong hỗn hợp phản ứng. Một quá trình
tách chiết ADN tốt sẽ cho một dung dịch ADN có chất lượng cao và nồng độ
đủ để phản ứng PCR cho kết quả dương tính.
CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

17
- Theo kết quả của Bảng 2, giới hạn phát hiện của PCR đa mồi xác định
Salmonella trực tiếp từ phân là 10
6
CFU/ml. Trong khi đó, độ nhạy của phản
ứng PCR với ADN tách chiết trực tiếp từ phân bằng bộ kit thương phẩm
QIAamp là 10
7

pneumoniae,
Enterobacter spp, chủng E. coli ATCC 11775 và 5 chủng E. coli gây tiêu chảy
thuộc các loại (EAEC, EHEC, EIEC, EPEC, và ETEC). Kết quả nghiên cứu
cho thấy, với tất cả các chủng vi khuẩn được thử nghiệm, PCR đều cho kết
CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

18
quả âm tính. PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân, hoàn toàn đặc
hiệu với các Salmonella. Không có hiện tượng âm tính giả với các vi khuẩn
khác trong đường tiêu hóa.
- Thực chất, độ đặc hiệu của phản ứng PCR chính là độ đặc hiệu của
các cặp mồi sử dụng. Cặp mồi phải được lựa chọn sao cho có khả năng ghép
cặp tốt với trình tự ở 2 đầ
u của đoạn DNA đích. Kết quả xác định độ đặc hiệu
ghi nhận được còn cho thấy, đoạn DNA đích được lựa chọn để khuyếch đại,
có trình tự các nucleotid trong đoạn gen tương đối ổn định và xuất hiện với tần
số cao ở các chủng Salmonella; nhưng lại không thấy trên DNA của các chủng
vi khuẩn đường ruột khác.
- Một nghiên cứu trướ
c đây đã sử dụng cặp mồi OMPCF và OMPCR
xác định các Salmonella. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi thử với các chủng
Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia
coli, Hafnia alvei, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas
aeruginosa, Shigella boydii, PCR cho kết quả Âm tính.
- Tuy nhiên, kết quả của nghiên cứu được thực hiện với ADN tách chiết
từ các chủng vi khuẩn thuần. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng sử dụng
cặp mồi nêu trên, nhưng lại thực hiện với ADN được tách chiết trực tiếp từ
phân.
Điều đó có nghĩa là dung dịch ADN tách chiết được, không chỉ có chứa
ADN của các chủng vi khuẩn mà chúng tôi trộn vào, mà còn có ADN từ nhiều

- Hai mươi bốn giờ phát hiện salmonella spp. trong thực phẩm bằng phương
pháp PCR _ Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên.Viện
Pasteur Tp. Hồ Chi Minh .

- Nguyễn Tiến Dũng, Phát hiện phân biệt Salmonella spp. và S.enterica I bằng
PCR và khảo sát tần số xuất hiện tương đối của S.enterica I trong thủy sản,
nước tự nhiện. Luận văn th
ạc sĩ khoa học-Trường ĐHKHTN TP.Hồ Chí Minh
2002.
- Nguyễn Văn Hòa. Nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện
Salmonella spp. trong thủy sản. Luận văn thạc sĩ khoa học-Trường ĐHKHTN
TP.Hồ Chí Minh 1999.