TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
TRẦN THỊ ĐAN THANH
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ
TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN
TRÊN CÁ TRA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ
TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN
TRÊN CÁ TRA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH
ĐẶNG THỤY MAI THY 2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

i
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

ii

TÓM TẮT Sau khi được phục hồi từ nguồn vi khuẩn trong bộ sưu tập 10 chủng 3B3, E3,
E8, CAF260, T8, A1, CAF255, STL303, CAF258, E223 được kiểm tra kháng
sinh đồ trên 2 loại kháng sinh ampicillin và chloramphenicol. Đồng thời vi
khuẩn cũng được dùng cho thí nghiệm MTT. Kết quả thu được ở cả phương
pháp kháng sinh đồ và MTT đều cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn nhạy với 2
kháng sinh ngoại trừ chủng CAF258, E223 kháng ampicillin và chủng T8


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

iiiMỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
Chương I: GIỚI THIỆU 1
Chuơng II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra 2
2.2 Bệnh mủ gan 2
2.2.1 Tác nhân gây bệnh 2
2.2.2 Đường lây truyền 3
2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý 3
2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản 3
2.3.1 Định nghĩa 4
2.3.2 Nguyên tắc phối hợp kháng sinh trong điều trị 4
2.3.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh 5

MTT và phương pháp kháng sinh đồ 33
4.2 Kết quả thí nghiệm trên mô tươi 34
4.2.1 Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh 34
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41
5.1 Kết luận 41
5.1.1 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo kháng sinh đồ 41
5.1.2 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo thí nghiệm MTT 41
5.1.3 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên mô theo thí nghiệm MTT 41
5.2 Đề xuất 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
PHỤ LỤC 46



Bảng 4.1: Đường kính trung bình vòng vô trùng của 10 chủng vi khuẩn 22

Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh qua phương pháp
kháng sinh đồ 23

Bảng 4.3: Sự sai khác của vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh qua thí
nghiệm MTT 26

Bảng 4.4: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm
MTT trên vi khuẩn 27

Bảng 4.5: Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh qua thí
nghiệm MTT 36
Bảng 4.6: Số lượng tế bào tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm
MTT trên mô 37
cfu/ml còn tồn tại sau khi sử
dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 30

Hình 4.6: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10
7
cfu/ml còn tồn tại sau khi sử
dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ
30

Hình 4.7: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10
6
cfu/ml còn tồn tại sau khi sử
dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 31

Hình 4.8: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10
6
cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh
đồ 31

Hình 4.9: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10
5
cfu/ml còn tồn tại sau khi sử
dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 32

Hình 4.10: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10
5
cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ
32

CK Cá khỏe.
CB Cá bệnh.
KS Kháng sinh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

1
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

Nội dung:
Dùng MTT để ước lượng mật độ vi khuẩn có trong dịch mô bệnh phẩm và
dịch huyền phù từ khuẩn lạc.
Kiểm tra tính nhạy của vi khuẩn trong 2 biện pháp trên với một số loại kháng
sinh .
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

2
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra
Phong trào nuôi cá tra tại Việt Nam ngày càng được nhân rộng để phục vụ cho
nhu cầu tiêu thụ trong nước và đặc biệt là xuất khẩu. Từ năm 1996-2006, diện
tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần; sản lượng tăng 36,2 lần. Tổng diện tích
nuôi cá tra, cá ba sa trong toàn khu vực ĐBSCL hiện đã lên đến 5.000 ha.
Năm 2001 tổng sản lượng cá tra, cá ba sa của toàn vùng mới chỉ được 110.000
tấn thì đến năm 2006 là 825.000 tấn và dự báo năm 2007 sẽ vượt quá 1 triệu
tấn, bằng sản lượng quy hoạch cho đến năm 2010. Tại TP Cần Thơ, theo dự
báo năm 2007 sẽ tăng thêm khoảng 10% sản lượng sản phẩm cá tra xuất khẩu
(nguồn:www.nafiqaved.gov.vn,14/11/2008). Hiện nay, cá tra đã được xuất
khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ. Để có sản lượng cao cung cấp cho
xuất khẩu, bên cạnh tăng diện tích nuôi trồng thì còn nuôi thâm canh ở mật độ
cao làm xuất hiện nhiều loại bệnh như đốm trắng nội tạng do Edwardsiella
ictaluri, đốm đỏ do Pseudomonas , bệnh nhiễm huyết do Edwardsiella tarda,
một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra. Theo Lý Thị Thanh Loan (2008) ở
các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long tỉ lệ mủ gan là cao nhất so với các loại
bệnh khác: 52,8%. Tại An Giang bệnh chiếm tỉ lệ cao nhất đạt 66,7%, kế đến
là Cần Thơ: 54,89%; Vĩnh Long 53,8%; Đồng Tháp 36% (www.agriviet.com,
14/11/2008). Cao điểm dịch bệnh thường xảy ra từ tháng 9 đến tháng 12 hằng
năm vào thời kỳ thời tiết chuyển mát (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007); đặc
biệt bệnh xuất hiện không phụ thuộc vào mùa vụ thả giống hay lứa tuổi cá.

2.2.2 Đường lây truyền
Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô. Edwardsella
ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng hai đường khác nhau. Vi khuẩn trong nước
có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển
vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não, bệnh lan rộng từ màng não đến
sọ và da (Shotts và ctv, 1986).
E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc ruột vào
máu gây nhiễm trùng máu. Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong
biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da. Cá còn nhiễm E. ictaluri qua đường
miệng gây nhiễm khuẩn ruột (Shott và ctv, 1986).
2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý
Cá bệnh do nhiễm vi khuẩn E. ictaluri thường thể hiện kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy
yếu , bụng thường chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc
vây xuất huyết, mắt lồi. Giải phẫu bên trong, một số cơ quan nội tạng như gan,
lá lách, thận bị hoại tử tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,5-
2,5mm (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).
2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản
Khi bệnh xảy ra trong ao, nông dân thường sử dụng các sản phẩm thuốc thú y-
thủy sản chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá. Tuy
nhiên theo Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) việc sử dụng kháng sinh còn tùy
tiện, không đúng về liều lượng và liệu trình điều trị. Nông dân thường dùng
kháng sinh liều thấp để phòng bệnh cho cá. Vì vậy hiệu quả điều trị kháng
sinh ngày càng giảm và hình thành khả năng kháng thuốc cho vi khuẩn.
Theo Bùi Thị Tho (2003) trong điều trị các bệnh truyền nhiễm nên có chiến
lược sử dụng kháng sinh phù hợp, bao giờ cũng chọn thuốc mà vi khuẩn mẫn
cảm nhất và chỉ nên phối hợp kháng sinh khi bị nhiễm đồng thời nhiều vi
khuẩn hay khi phối hợp sẽ diệt được vi khuẩn kháng thuốc.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

4

phối hợp kháng sinh:
• Các thuốc ức chế và tiêu diệt vi khuẩn có thể có tác dụng đối kháng, tác
dụng cộng hay tác dụng độc lập.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

5
• Đối kháng không phải nguyên nhân giữa các thành viên khi phối hợp
(ức chế hay diệt khuẩn).
• Phối hợp những kháng sinh ức chế vi khuẩn chưa bao giờ có tác dụng
hiệp đồng, cộng và độc lập.
• Phối hợp các kháng sinh diệt khuẩn có thể có tác dụng hiệp đồng, cộng
và độc lập.
• Phối hợp điều trị chỉ sử dụng theo chỉ định: nhiễm trùng hỗn hợp, vi
khuẩn hoàn toàn kháng thuốc hay đề phòng sự xuất hiện các chủng vi
khuẩn kháng thuốc.
Các phối hợp đã được công nhận có tác dụng tốt trên lâm sàng (Bùi Thị
Tho, 2003):
Ø Chloramphenicol/Gentamicin
Ø Lincomycin/Eythromycin
Ø Chloramphenicol/Ampicillin
Ø Ampicillin/Streptomycin
Ø Ampicillin/Gentamicin
Ø Lincomycin/Streptomycin
2.3.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh
Theo Benbrook (2002) tất cả các loại thuốc sử dụng trong nuôi trồng thủy sản
phải được sự phê chuẩn của Trung tâm Thuốc thú y thuộc FDA và hầu hết các
loại kháng sinh được dùng cho cá đều có bổ sung thêm vào công thức thức ăn.
Tuy nhiên lượng kháng sinh đó chỉ được cá hấp thụ 75% còn lại thì vào môi
trường nước (Goldburg & Triplett, 1997 được trích dẫn bởi Benbrook, 2002).
Có 5 loại thuốc được phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản tại Mĩ, trong đó

Pseudomonas ngoại trừ norfloxacin (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như
Ngọc, 2002).
Nhóm Aminosid: có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết vi khuẩn gram âm
và một số vi khuẩn gram dương hiếu khí, ít tác dụng đối với vi khuẩn kỵ khí vì
aminoasid thấm qua màng tế bào vi khuẩn một phần nhờ hệ thống vận chuyển
hoạt động phụ thuộc vào oxygen nên vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối không chịu tác
động của Aminosid (Trần Thị Thu Hằng, 2006).
Nhóm Phenicol: là những kháng sinh kìm khuẩn, phổ kháng khuẩn rộng và
khả năng phân tán tốt vào các mô cơ thể. Cloramphenicol rất được ưa chuộng
trong trị liệu. Tuy nhiên từ 1950 sự phát triển độc tính đáng kể trên cơ quan
tạo máu đã giới hạn việc sử dụng kháng sinh này (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn
Thị Như Ngọc, 2002) và hiện nay lại cấm sử dụng trong thú y do phát hiện
được những tác hại của thuốc: gây suy tủy, tỷ lệ quái thai cao, gây dị ứng…
Đặc biệt nếu dùng thường xuyên để điều trị bệnh cho động vật sẽ rất nguy hại
do chúng để lại tồn lưu các sản phẩm dùng làm thức ăn cho người từ động vật
(Bùi Thị Tho, 2003).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

7
2.3.4 Cơ chế của sự kháng thuốc
Theo Dixon (2007) cho rằng một dòng vi khuẩn đã kháng kháng sinh có thể
truyền gen kháng thuốc là plasmid và hiện tượng kháng thuốc có nguy cơ xảy
ra ở hầu hết các loại kháng sinh đã dùng trong nuôi trồng thủy sản. Hiện tượng
kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác động
của các loại kháng sinh. Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi
sinh vật tạo ra kháng sinh nhằm bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng
sinh này (Ricki, 1995).

Một số kết quả nghiên cứu kháng sinh trên E .ictaluri
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

8
Crumlish & ctv (2002) ghi nhận các chủng E. ictaluri phân lập trên cá tra ở
Việt Nam nhạy cảm hoàn toàn với amoxycillin, florfenicol. E. ictaluri được
phân lập từ cá nheo Mỹ cũng hoàn toàn nhạy cảm với florfenicol. Ngoài ra vi
khuẩn E. ictaluri trên cá tra còn kháng với một số loại thuốc kháng sinh
oxytetracylin, oxolinic acid, sulphonamid (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).
Bên cạnh đó theo Nguyễn Thanh Phương và ctv (2005), 13 chủng E. ictaluri
phân lập trên cá tra tại ĐBSCL đều kháng với oxytetracylin, oxolinic acid và
sulphonamid. Vẫn trên đối tượng E. ictaluri theo Cao Tuấn Anh và ctv
(2006) kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 17 loại kháng sinh trên 8 chủng vi
khuẩn thì tất cả đều nhạy với doxycilin, ofloxacin và kháng với 15 loại kháng
sinh còn lại norfloxacin, oxolonic acid, pefloxacin, colistin, streptomycin,
cefipime, sulfamethoxazole/trimethroprime, cetriaxone, cefazolin,
gentamycin, aztreonam, cefixime, cefotaxime, oxytetracylin và amoxicillin.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) 100% chủng E. ictaluri
phân lập được đều đề kháng với sulfamethoxazole, gần như tuyệt đối với
Colistin (97,9%); và tác giả đã nhận xét Edwardsiella ictaluri còn kháng với
các lọai kháng sinh như sau: florphenicol (42,5%), amoxicilin (40,4%),
tetracyclin (31,9%), doxycyclin (27,7%). Cùng với thời gian đó, Huỳnh Chí
Thanh (2007) đã tiến hành nghiên cứu sự mẫn cảm của E. ictaluri phân lập từ
cá tra tại An Giang , nhận thấy rằng vi khuẩn mẫn cảm cao với kháng sinh
cefazoline, doxycilin, cefalexin; kháng với amoxicillin, aztreonam,
sulfamethoxazole/ trimethroprime, streptomycin, oxolinic acid, gentamycin và
mẫn cảm trung bình với enrofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, pefloxacin.
Ngoài ra, theo kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của vi khuẩn E. ictaluri gây
bệnh trên cá tra (chủng E223) của Tiết Ngọc Trân (2007) cho rằng vi khuẩn
nhạy với ofloxacin, cefazolin, doxycylin và ceferime (đường kính vòng tròn

pháp thuận lợi để ước lượng mật độ tế bào đồng thời là công cụ quan trọng
cho nhiều lĩnh vực nghiên cứu rộng lớn. Trong thí nghiệm MTT, muối
tetrazolium vàng được biến đổi trong hoạt động chuyển hóa của tế bào hình
thành tinh thể formazan không tan màu tía. Sau đó tinh thể này sẽ được hòa
tan khi cho chất tẩy vào. Màu sắc sau đó sẽ được định lượng bởi máy đo phổ.
Ở mỗi loại tế bào, sẽ thiết lập nên mối quan hệ tuyến tính giữa số tế bào và
khả năng hấp thu, vì thế giúp xác định số lượng thay đổi trong tăng trưởng
chính xác và trung thực. Một trong số những ứng dụng cho phương pháp này
là xác định khả năng nhạy của thuốc, độc lực, phản ứng lại các yếu tố tăng
trưởng và hoạt động tế bào.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

10

2.4.2. Những điểm đặc trưng của thí nghiệm MTT
Theo ATCC ( ) thí nghiệm MTT có những ưu điểm sau:
- Tính ứng dụng cao: phương pháp này đã được áp dụng rông rãi trong
nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau.
- Sự đo lường chính xác: phép đo phổ có thể phát hiện những sự thay đổi
rất nhỏ trong sự chuyển hóa của tế bào, nhạy hơn rất nhiều so với sự
nhuộm màu bằng trypan blue.
- Thuốc thử an toàn: không cần trữ và kích hoạt các chất phóng xạ bằng
tay.
- Dễ sử dụng: thao tác tương đối đơn giản và sử dụng những thiết bị có
sẵn trong hầu hết các phòng thí nghiệm.
- Thao tác nhanh: thí nghiệm hoạt động trên đĩa 96 giếng và đọc kết quả
bằng máy microtitre plate reader, cho phép đưa một số lượng lớn mẫu

Bên cạnh đó Freimoser (1999) cho rằng phương pháp sử dụng thiết bị đo màu
để xác định mật số tế bào bằng cách dùng MTT chính xác và tiết kiệm thời
gian hơn so với việc đếm mẫu máu truyền thống. Một phương pháp khởi đầu
cho việc phát triển một phép phân tích nhanh về sự sinh trưởng và tồn tại tế
bào lympho của động vật hữu nhũ dựa trên sự biến đổi và sự xác định số
lượng của MTT bằng thiết bị đo màu. Tổng số tinh thể có thể được xác định
bằng phép đo phổ từ đó dẫn đến xác định số lượng tế bào sống trong mẫu.
Những điểm đặc trưng này có thể mang đến thuân lợi trong việc phân tích độc
tố hay sự sinh sôi của tế bào, được sử dụng rộng rãi trong miễn dịch học, độc
chất học, sinh học phân tử.
Theo Freimoser (1999) thuận lợi của MTT là phương pháp chính xác, mức độ
tin cậy cao và tiết kiệm được ít nhất 80% thời gian tiến hành thí nghiệm. Đặc
biệt phương pháp MTT có thể xác định mật số tế bào trong thể tích nuôi rất
nhỏ. Cũng cùng nhận xét về ưu điểm của MTT, Zorrilla (2001) cho rằng
phương pháp này giúp việc xác định số lượng và so sánh khách quan về nồng
độ gây độc của các sản phẩm ngoại bào trên các vi sinh vật gây bệnh cho cá.
Vì thế kết quả thu được chính xác hơn so với phương pháp đếm truyền thống
với trypan blue.
Ngoài những ưu điểm trên theo Caviedes (2002) sử dụng MTT để xác định sự
mẫn cảm của kháng sinh còn giảm được giá thành trong quá trình tiến hành thí
nghiệm; tác giả cho rằng kiểm tra khả năng đề kháng kháng sinh của mỗi
chủng Mycobacterium tuberculosis cần 7,54$ nếu sử dụng Alamar Blue,
nhưng với MTT giá thành giảm còn 5,04$.
Ứng dụng những thành công trong các nghiên cứu trước đây về thí nghiệm
MTT, Schrader (2006) cũng đã tiến hành thí nghiệm trên đĩa 96 giếng, tìm
hiểu về khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên
cá da trơn và Flavobacterium columnare. Tác giả nhận xét rằng trước đây các
lọai thức ăn thủy sản thường được tẩm các kháng sinh như oxytetracycline,
sulfadimethoxine/ormetoprim; đến năm 2005 florfenicol lại được xem như
một loại kháng sinh có hiệu quả trong việc điều trị bệnh ESC trên cá trơn. Tuy

ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Kết quả rifampin không làm giảm nhiều
tế bào ở nồng độ 5µM nhưng lại làm giảm tế bào ở các nồng độ còn lại. Khi
đó số lượng tế bào giảm 12,32%, 37,58%, 55,63% và 77,62% tương ứng ở các
nồng độ 5, 10, 2, 50 và 100µM.
Ngoài ra MTT còn được sử dụng khá phổ biến trong y học, theo nghiên cứu
Trần Quang Tuấn và ctv (www.cimsi.org.vn, 18/11/2008) về mô hình và
chiều hướng đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân sẩy thai liên tiếp, các tác giả đã
sử dụng chứng nghiệm chuyển dạng lympho bào để đánh giá khả nǎng hoạt
động của tế bào lympho cũng như khả nǎng và chiều hướng đáp ứng miễn
dịch của bệnh nhân.
Trong nghiên cứu của Trần Quang Tuấn đã sử dụng nguyên lý đánh giá kết
quả chuyển dạng lympho bào máu ngoại vi theo phương pháp MTT, áp dụng
kỹ thuật tạo màu do Mosmann mô tả nǎm 1983 và cải tiến theo phương pháp
của Denziot nǎm 1986 với nguyên lý: muối tetrazolium (MTT) màu vàng
được chuyển hóa trong ti thể của tế bào sống tạo thành sản phẩm formazan,
tạo ra tỉ lệ thuận giữa quá trình chuyển hóa tế bào và số lượng tế bào đang hoạt
động. Tế bào lympho trong máu của bệnh nhân được nuôi cấy với mật độ 10
5

tế bào lympho trong 100ml môi trường không có mặt PHA hoặc có mặt PHA
với nồng độ 7,5m g/ml. Sau 48 giờ thêm MTT để có nồng độ cuối cùng là
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

13

1mg/ml và ủ trong 3 giờ. Cuối giai đoạn ủ, loại bỏ môi trường bằng ly tâm.
Sau đó cho vào mỗi giếng 50ml isopropanol, toàn bộ phiến được lắc mạnh để
hòa tan toàn bộ chất màu formazan do tế bào tạo ra. Kết quả thu được (tính
theo chỉ số OD) đã so sánh khả nǎng hoạt động của tế bào lympho giữa các
nhóm nghiên cứu.

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 1- 5/2009.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản.
3.2 Nội dung thực hiện
- Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1
- Thực hiện kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn Bảng 3.1 (so sánh mật độ
vi khuẩn với ống McFarland 1, mật độ vi khuẩn khoảng 3x10
8
cfu/ml)
- Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù từ khuẩn
lạc.
- Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩntrong dịch mô bệnh phẩm (cá
bệnh).
- So sánh hiệu quả sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ
và thí nghiệm MTT trên vi khuẩn và mô tươi (cá bệnh).
3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
3.3.1 Đối tượng thí nghiệm
- Cá tra từ các đề tài nghiên cứu gây cảm nhiễm bệnh mủ gan.
3.3.2 Vật liệu
- Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn.
- Ống nghiệm, ống đong, đĩa petri, lame, lamella.
- Chai nấu môi trường, bình tam giác.
- Cá từ, , hộp đầu col, cối nghiền mẫu, cân, bộ tiểu phẫu.
- Que trãi thủy tinh.
3.3.3 Thiết bị
- Kính hiển vi.
- Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy.
- Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng.
- Micropipette, microplate, máy microplate reader.


(0.85% NaCl). So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ
3x10
8
cfu/ml) tiến hành pha loãng vi khuẩn ở các mật độ

10
5
, 10
6
, 10
7
và 10
8

cfu/ml (thí nghiệm MTT). Tương tự, cho vi khuẩn vào 2 ml nước muối sinh
lý. So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ 3x10
8
cfu/ml)
(kháng sinh đồ).

Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài
STT Mã
PTN
Địa điểm Cơ quan phân
lập
1

3B3

Ô Môn


C
ần Th
ơ

Th
ậ
n

6
A1 Hậu Giang Thận
7
CAF255 Châu Phú Thận
8

STL303
9
CAF258 Châu Phú Tỳ tạng
10
E223 Chủng tham khảo (Từ Thanh Dung, 2002) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

16

3.4.2 Kháng sinh đồ

Enrofloxacin ≤ 16mm 17-22mm ≥23mm
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version