Mã số chuyên ngành: 62 44 27 01 Phản biện 1: GS.TSKH. Nguyễn Công Hào
Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng
Phản biện 3: PGS.TS. Trương Thế Kỷ
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Văn Thị
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. GS.TS. Chu Phạm Ngọc Sơn
2. TS. Trầ
n Kim Tính Tp. Hồ Chí Minh - 2011
Trang 1
MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài
Trong lĩnh vực dược phẩm, β-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị
bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là salbutamol và clenbuterol
[14]
. Salbutamol được dùng
cho người với tên biệt dược là albuterol, salbutamol…Clenbuterol được dùng với tên biệt
dược là broncodil, clenburol, ventolax, protovent (Theo tài liệu trên trang web Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm
làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu,
các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng


Mục đích nghiên cứu
Đề tài này được thực hiện với mong muốn:
• Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịt
gia súc, gia cầm bằ
ng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao,
đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước.
• Theo dõi mức độ tồn lưu của clen và sal trong thực phẩm gà, heo khi nuôi gà, heo với
thức ăn có chứa clen và sal.
• Điều tra sơ bộ tình hình sử dụng hợp chất β-agonist, cụ thể là sal và clen, trong thức ăn
gia súc và kh
ả năng tồn lưu của chúng trong thịt gia súc ở một số tỉnh đồng bằng sông
Trang 2
Cửu Long (Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang).
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
a. Các mẫu thức ăn gia súc: lấy mẫu từ các cơ sở bán thức ăn gia súc, gia cầm gồm một số
loại được ký hiệu như sau: NH, MT, HG, CTC, CC, CG, TAS80, ST, ADBC, ODBAS,
TA11C30, TATNB, TĐĐ 6711, CT (mẫu được lấy từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 9 năm
2009).
b. Mẫu thịt heo, thịt gà nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứ
a nồng độ nhất định clen và sal
để kiểm tra khả năng tồn lưu của hai chất nầy.
c. Mẫu thịt dùng cho điều tra được lấy từ các tỉnh Vĩnh Long, Hậu Giang, Thành phố Cần
Thơ
d. Thiết bị phân tích
• Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS TSQ Quantum Access của Thermo
Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh)
•
Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 1 tứ cực LC/MS 2010A của Shimadzu (Công ty dịch vụ
KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh)
Trang 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở nước ngoài và trong nước.
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Năm 2001, tác giả Woodward K.N
[77]
thuộc viện nghiên cứu về thuốc thú y ở Anh đã
nghiên cứu quá trình chuyển hóa và độc tính của clenbuterol trên một số loài động vật
(chuột, khỉ, trâu, bò, ngựa).
Các tác giả Warriss P. D và cộng sự (1990 và 1991)
[73],[74]
, Fawcett J. P và cộng sự
(2004)
[40]
đã nghiên cứu ảnh hưởng của salbutamol lên thịt heo, các chuyển hóa về mặt sinh
học của gia súc khi sử dụng hợp chất này.
Theo các tài liệu đã công bố, từ năm 1990 đến 2011, nhiều tác giả đã nghiên cứu
phương pháp phân tích clenbuterol, bằng LC-MS, LC-MS/MS với các giá trị LOD cho
clenbuterol trong nhiều nền mẫu khác nhau (thịt, gan, thận, thức ăn chăn nuôi, mẫu máu )
thường đạt từ 0,02 dến 9 ppb
[33]; [34],[41],[50],[54],[72],[75]
; với phương pháp phân tích β-agonist
trên các nền mẫu sinh học bằng sắc ký khí (GC-MS), các nghiên cứu được công bố cho giá
trị LOD của clenbuterol < 0,5 ppb hoặc không công bố giá trị LOD
[55]
. Riêng trong năm
1999, Guy và cộng sự

tài bộ kit phát hiệ
n nhanh chất clenbuterol trong thịt gia súc gia cầm trong thời gian 2 giờ.
Tuy nhiên, đây chỉ là phương pháp định tính dựa trên sự biến đổi màu của thuốc thử.
Năm 2010, Nguyễn Thị Chân và cộng sự
[2]
thuộc trung tâm phân tích và thí nghiệm
TPHCM, đã nghiên cứu đề tài “ Xác định clenbuterol trong thịt heo bằng phương pháp sắc
ký lỏng ghép khối phổ triplequad (LC-MS/MS) ” giới hạn phát hiện LOD = 0,03ppb. Nhóm
nghiên cứu không sử dụng nội chuẩn đồng vị và do đó không tận dụng được ưu thế của loại
nội chuẩn nầy.
Trang 4
1.2. Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ β-agonists
1.2.1. Clenbuterol

- Công thức phân tử : C
12
H
18
Cl
2
ON
2
- Khối lượng phân tử: 276,0796 đvC

- Công thức cấu tạo
Cl
Cl
H
2
N

Thuốc điều trị bệnh hen suyễn có chứa salbutamol có nhiều trên thị trường trong nước cũng
như trên thế giới.

Tác dụng của clenbuterol và salbutamol lên động vật nuôi và người

Clenbuterol và salbutamol tích lũy trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khỏe
người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim,
tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,…

1.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Thiết bị gồm các bộ phận chính: bơm chịu áp suất (pump), van tiêm mẫu (injector),
cột sắc ký lỏng (column), đầu dò (detector) và phần điều khiển và xử lý số liệu (data
processor).
Bộ phân tích khối ba tứ cực Với hệ thống ba tứ cực, chế độ vận hành rất phong phú, cho
phép có nhiều thông tin hữu ích trong phân tích, thí dụ có thể chạy Full Scan, SIM, Full
Scan MS/MS hay Product ion, SRM (Selected Reaction Monitoring).
Trang 5

1.4. Quy trình định tính và định lượng β- agonists (salbutamol và clenbuterol)
Hầu hết các phương pháp phân tích sắc ký dùng phát hiện và định lượng salbutamol và
clenbuterol đều trãi qua ba giai đoạn như sau
• Chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu (mẫu nguyên liệu)
• Làm sạch mẫu, loại tạp chất ra khỏi dịch chiết và làm giàu chất phân tích
• Sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân tích.
Trang 6
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Thiết bị và hóa chất
2.1.1. Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm:
• Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm và hệ thống tiêm mẫu tự động
• Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI và
APCI
• Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm,
cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck)
• Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử
lý dữ liệu sắc ký
2.1.2. Hóa chất và dung dịch thử
• Nước cất 2 lần khử ion, CH
3
OH loại HPLC; H
3
PO
4
, p.a (pure analysis); HCOOH
loại HPLC và K
2
HPO
4
, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K
2
HPO

H
22
O
3
N, ½ H
2
SO
4

• Salbutamol–d
3
(100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C
13
H
19
D
3
O
3
N).

2.2. Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC-MS/MS.
2.2.1 Khảo sát quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội chuẩn (Sử dụng chế độ
Full scan)
Để đảm bảo độ phân giải và độ nhạy của thiết bị LC-MS/MS trong phân tích vết
clenbuterol (clen) và salbutamol (sal), cần phải tối ưu hóa các thông số vận hành của máy.
Quá trình khảo sát gồm các bước sau:
- Chuẩn bị dung dịch của riêng từng chấ
t sal sulfate, clen hydrochloride, sal-d
3

O (10:90).
─ Tiến hành phân tích hỗn hợp dung dịch chuẩn vừa chuẩn bị với các thông số đã tối ưu
hóa, dùng cột sắc ký C18 và pha động chạy HPLC theo chương trình đẳng dòng (tốc độ
dòng 0,5ml/phút)
2.2.4.2. Khảo sát thành phần pha động theo chương trình gradient
Với tốc độ dòng đã chọn, tiến hành khảo sát chương trình gradient dung môi bằng cách
phân tích hỗn hợp dung dịch chuẩn 5ppb clen và sal đã chuẩn bị. Tính độ phân giải R
S
và
hệ số đối xứng A
S
theo công thức sau.

21
12
0,5( )
RR
S
tt
R
WW
−
=
+
với
2
R
t
: thời gian lưu của chất phân tích 2 (clenbuterol)
1

phải của đường ngang vẽ ở 10%
chiều cao mũi sắc ký
Yêu cầu
: Mũi sắc ký được chấp
nhận khi 0,9 < A
S
< 1,2

2.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính của clen và sal trong xây dựng đường chuẩn
Do clen và sal bị cấm không được có theo tiêu chuẩn Việt Nam nên phần đánh giá
khoảng tuyến tính cần khảo sát với khoảng nồng độ sal, clen ≤ 200μg/L (ppb). Với các mẫu
có nồng độ C
o
(nồng độ cuối khi tiêm vào máy) vượt quá 200μg/L, cần giảm lượng mẫu
cân.
Đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, bình phương hệ số tương quan lớn hơn 0,99.
Dung dịch chuẩn được pha chế từ chuẩn gốc có nồng độ clen:118 ppm, sal: 189ppm

2.3. Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu.
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ lại clen, sal và nội chuẩn
đồng vị trên c
ột SCX.
─ Bước 1: Chuẩn bị 6 ống ly tâm nhựa 50ml. Mỗi ống ly tâm chứa:
0,1ml hỗn hợp nội chuẩn (sal-d
3
: 4ppb; clen-d
9
: 2ppb) + 0,1ml hỗn hợp chuẩn gồm (sal:
7,763 ppb; clen: 1,981ppb) + 10ml K
2

các thông số đã được tối ưu hóa.

2.3.2. Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn clen và sal.
Sử dụng các thông số kỹ thuật đã được tối ưu hóa của hệ thống LC/MS/MS để khảo
sát độ lặp lại củ
a tín hiệu đo trên 6 lần lặp lại, khi thêm 1ml chuẩn clen nồng độ 0,495ppb,
chuẩn sal nồng độ 0,776 ppb, (chứa nội chuẩn xác định clen-d
9
và sal-d
3
) vào mẫu trắng,
tách chiết, làm sạch và định mức cuối cùng là 1ml với pha động.
Các đại lượng thời gian lưu trung bình
R
t , độ lệch chuẩn trung bình (RSD%) được xác
định dựa trên kết quả phân tích và được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel.

2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích
Trong phân tích LC-MS/MS, nền mẫu có thể ảnh hưởng lớn trên kết quả phân tích ở
hai giai đoạn: chuẩn bị mẫu (hiệu suất tách chiết giảm) và định lượng trên đầu dò khối phổ
(hiệu suất tạo ion), nên có hiện tượng khử ion. Một cách khắc phục hiệu ứng không tốt của
nền mẫu là dùng nội chuẩn đồng vị. Do chuẩn và nội chuẩn có thời gian lưu xem như bằng
nhau, ảnh hưởng của nền mẫu trên chuẩn và nội chuẩn trong hai giai đoạn chuẩn bị mẫu và
định lượng trên đầu dò khối phổ về nguyên tắc là giống nhau. Với clen và sal, nội chuẩn
đồng vị lần lượt là clen-d
9
và sal-d
3
.
Để định lượng clen và sal, đường chuẩn được xây dựng trên nền mẫu như sau:

2.3.5. Xác định hiệu suất thu hồi
Xác định hiệu suất thu hồi của clen và sal trên mẫu trắng, trên nền thịt, TACN, gan
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: 1ml dung dịch chuẩn sal và clen trong MeOH ở các nồng độ
khác nhau:
Clen: 0,1; 0,25; 0,5; 1; 10; 20 ; 50; 100 μg/L (ppb)
Sal: 1,6 ; 4; 10; 50; 100 ; 155 μg/L (ppb)
Sử dụng mẫu trắng Chuẩn bị các mẫu thịt (gan) và thức ăn chăn nuôi, mỗi mẫu 2g, cho
vào các ống ly tâm nhựa dung tích 50mL. Bổ sung các dung dịch chuẩn sao cho nồng độ

mỗi chất trong mẫu từ 0,05 - 75 μg/L (ppb) theo dãy nồng độ đã nêu, (thực hiện 03 lần), để
yên 1 giờ. Sau đó, tách chiết làm sạch (chọn pH = 6,0 ở bước 2).
Yêu cầu
: Độ lệch chuẩn (RSD%) tính theo diện tích pic sắc kí của 03 lần thực hiện riêng
biệt trên cùng một nồng độ phải nhỏ hơn 10 %.
• Hiệu suất thu hồi trên các nền mẫu khác nhau phải đáp ứng quy định của châu Âu
(theo 2002/657/EC):
• Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm được tính theo công thức sau: Trong đó: - X: nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm, μg/kg hoặc μg/L
- C
o
: nồng độ chất cần phân tích tính từ đường chuẩn, μg/L
- 1: Thể tích định mức 1 mL
- m: khối lượng mẫu (g) hoặc (V) thể tích mẫu phân tích, (mL)

2.4. Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp (LOD, LOQ)
Thêm dung dịch chuẩn sal, clen vào mẫu thức ăn chăn nuôi và mẫu thịt (mẫu trắng) sao
cho hàm lượng các chất có trong mẫu khá nhỏ. Xử lý mẫu và thực hiện phân tích trên
thiết bị

trọng lượng 0,6 ± 0,1kg trong thời gian 21 ngày
Thức ăn và khẩu phần thí nghiệm: Thức ăn được mua một lần tại địa điểm bán thức ăn
vào đầu thí nghiệm, phối hợp thành một khẩu phần cơ sở, các nghiệm thức được bổ sung
Trang 10
chất kích thích tăng trưởng clen và sal (với hàm lượng lần lượt là 0; 200; 300; 500 ppb cho
mỗi chất )
Công thức thức ăn thí nghiệm được bố trí như sau:
Nghiệm thức đối chứng (ĐC): Khẩu phần cơ sở (KPCS) (A)
Nghiệm thức 1 (NT
1
): KPCS + 200 ppb clen + 200 ppb sal (B)
Nghiệm thức 2 (NT
2
): KPCS + 300 ppb clen + 300 ppb sal (C)
Nghiệm thức 3 (NT
3
): KPCS + 500 ppb clen + 500 ppb sal (D)
Các khẩu phần thí nghiệm sau khi phối trộn dạng bột được đem đóng viên tại nhà máy
thức ăn khoa Thủy Sản, Đại Học Cần thơ để đảm bảo viên có đường kính 4mm
Công thức phối hợp khẩu phần cơ sở :
- Nguyên liệu thực phẩm: Bắp (42%); Tấm (18%); Cám (20%); Bánh đậu nành (13%);
Bột cá (5%); Dicalcium phosphate (1%); Thyromin(0,5%).
- Thành phần hóa học và đinh dưỡng: Ẩ
m độ (12,73%); Hàm lượng tro (7,93%);
protein thô (crude protein):18,11%; Chiết chất ether hay béo thô (Ether Extract):
(4,9%), Xơ thô (Crude Fibre): 6,13%, Chiết chất không đạm (Nitrogen free
extractives): 62,93%, Năng lượng trao đổi (Metabolizable Energy):3224kcal/Kg)
*

* Metabolizable Energy: được tính theo Jansen, 1989.

Đối chứng : 1 heo ăn khẩu phần cơ sở (không cho ăn chất kích thích tăng trưởng).
Thí nghiệm: 2 heo với khẩu phần cơ sở + 500ppb clen và 2 heo với khẩu phần cơ sở +
500ppb sal
c. Thức ăn thí nghiệm
Thức ăn tự chế với thành phần gồm cám, gạo, các vitamin dạng premix (khẩu phần cơ sở)
có trộn thêm chất kích thích tăng trưởng clen và sal với hàm lượng 500ppb cho mỗi loại.
Các kh
ẩu phần thí nghiệm sau khi phối trộn và được xay nhuyễn ở dạng bột

2.6.2. Phương pháp thí nghiệm
a. Chăm sóc nuôi dưỡng: heo được nuôi riêng mỗi con ở một chuồng khác nhau và
ăn riêng. Thức ăn được cân một lần trong ngày, cho vào xô đựng riêng biệt cho từng đơn vị
thí nghiệm, heo được cho ăn ba lần trong ngày, cuối ngày cân lượng thức ăn còn thừa.
b. Mổ khảo sát: Đến cuối thí nghiệm, tất cả 5 con heo được tiế
n hành mổ khảo sát để
lấy mẫu phân tích. Mẫu được ký hiệu theo từng nghiệm thức và trữ đông ở -18
o
C. Tổng số
mẫu khảo sát: 5 loại mẫu thịt heo, 5 loại mẫu gan heo và 5 loại mẫu thận heo .
c. Các chỉ tiêu theo dõi
- Tiêu tốn thức ăn (g/ngày)
- Hệ số chuyển hóa thức ăn: xác định bằng cách chia tổng số thức ăn trong kỳ thí
nghiệm cho tăng trọng
- Dư lượng của clenbuterol và salbutamol trong thịt, gan và thận heo sau thời gian thử
nghiệm

2.7. Điều tra tình hình s
ử dụng clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi, thịt
heo, thịt gà ở thành phố Cần thơ, tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Hậu Giang trong thời
gian 3 năm từ tháng 7/2007 đến 12/2009


Bảng 3.1
. Các trị số m/z của clen, sal
Tên ion Clen Clen-d
9
Sal Sal-d
3

m/z tiền ion 277,05 286,05 240,10 243,10
m/z ion con 132,10 203,01 204,01 148,10 166,01 151,15 Hình 3.1.a. Cơ chế phân mảnh của clen

Hình 3.1.b.
Cơ chế phân mảnh của clen - d
9 Hình 3.2
.a. Cơ chế phân mảnh của sal

Hình 3.2.b. Cơ chế phân mảnh của sal-d
3
Bảng 3.6: Tóm tắt kết quả tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh tiền ion clen,
clen-d
9
; sal, sal-d
3


3.1.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ ống mao quản.
Việc khảo sát nhiệt độ ống mao quản được trình bày ở bảng 3.7.

Bảng 3.7.
Kết quả khảo sát nhiệt độ ống mao quản

Nhận xét
: Kết quả khảo sát từ bảng 3.7 cho thấy với nhiệt độ từ 325-350
o
C độ nhạy
các ion con của clen và sal đạt cao nhất, trong phân tích thực tế chọn nhiệt độ tối ưu của ống
mao quản là là 350
o
C.

3.1.4. Kết quả khảo sát chương trình dung môi.
3.1.4. 1. Khảo sát theo chương trình đẳng dòng
Kết quả khảo sát thời gian lưu của sal, và clen theo chương trình đẳng dòng được trình
bày ở bảng 3.8

Bảng 3.8
. Bảng kết quả thời gian lưu của sal, clen theo một số chương trình đẳng dòng
Thí
nghiệm
Pha động Thời gian lưu (phút)
H
2
O (a) MeOH (b) Clen Sal
1 10 90 2,91±0,02 2,87±0,02
2 20 80 2,89±0,02 2,83±0,02

01
243314 328691
337489
242525
Clen
A
203
,
01
897433 1534036
1499867
1159150
A
132
,
10
546681 800062 825808 603181
Loại ion Tỉ số m/z
Nhiệt độ ống mao quản (
o
C)
300 325
350
375
Sal
A
148
,
10
614378 898954

Pha động
Thời gian lưu
(phút)
Hệ số đối xứng của pic
sắc ký
A
S

Độ phân giải R
S
MeOH (a) H
2
O (a) Clen Sal Clen Sal

2
0-1 15 85

7,91
±0,02

5,70
±0,02
1,1 1,09 5,97
2 60 40
2,5-13 100 0
14-25 15 85
R
S
; A
S

trong bảng 3.14
Bảng 3.14
. Ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ clen, sal trên cột SCX
pH 5 5,5 6 6,5 7 7,5
A
148
,
10
4865775 4758080
4992276
4823494 4949243 4829415
A
203
,
01
1147949 1124791
1663487
1638758 1657720 1299969
Nhận xét: bảng 3.14 cho thấy, ở pH = 6,0 , diện tích của sal và clen có trị số cao nhất, do đó,
đệm pH = 6,0 là tối ưu cho việc chiết tách đồng thời cả hai chất clen và sal
Trang 15
3.2.2. Kết quả khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu.
Sau khi chọn được pH thích hợp, quy trình chuẩn bị mẫu được thực hiện như sau:

Hình 3.11
. Sơ đồ tóm tắt quy trình định lượng clen và sal

3.2.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn clen và sal.
Kết quả khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của clen và sal trong dung dịch, trong nền mẫu
thịt và TACN được trình bày trong bảng 3.17

T
(n=6)
(RSD %)
A
148
(sal) A
151
(sal)
Tỉ lệ trung bình
A
148/151

0,776 μg/L Thịt 5,38 (0,16) 325331 (1,24) 938110 (1,66) 0,347 (1,18)
0,77 6 μg/L TACN 5,28 (0,88) 323865 (1,16) 931993 (0,40) 0,348 (1,21)

Nhận xét
: Kết quả bảng 3.17 cho thấy với 6 lần phân tích mẫu, độ lêch chuẩn tương
đối của thời gian lưu không sai lệch nhiều (không vượt quá 1%), sự lặp lại của cường độ tín
hiệu của ion có m/z 151,15; m/z 204,01(ion định lượng của nội chuẩn sal-d
3
và clen-d
9
) biến
-
Thêm 1 mL dung dịch nội chuẩn sal-d
3
, clen-d
9
-
Thêm 5 mL đệm K

6ml K
2
HPO
4
(p
H= 6
)
Rửa cột lần lượt: 3 mL H
2
O, 3ml MeOH:H
2
O (10: 90),
rút nh
ẹ
chân khôn
g
để làm khô c
ộ
t
Rửa giải: 5ml MeOH: NH
4
OHđđ (95:5 v/v)
Thổi khô dun
g
d
ị
ch rửa
g
iải bằn
g

573269 5862573 20156858
A
132
,
10
173127 1735322 6087371
A
204
,
01
863398 880666 878939
Thêm vào mẫu thịt
sau khi xử lý
A
203
,
01
571549 5827398 20116544
A
132
,
10
170322 1759874 6155663
A
204
,
01
872032 873621 876302
Thêm vào mẫu
TACN sau khi xử lý

,
01
242862 1090671 5610425
A
151
,
15
1266598 1276731 1261532
Thêm vào mẫu thịt
sau khi xử lý
A
148
,
10
870722 3811608 19835558
A
166
,
01
248156 1128236 5970503
A
151
,
15
1280539 1269101 1245066
Thêm vào mẫu
TACN sau khi xử lý
A
148
,


3.2.5. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của clen, sal
Đường chuẩn dùng để xác định hiệu suất thu hồi được xây dựng trên dung dịch và trên
các nền mẫu thịt, TACN, gan.
Hiệu suất thu hồi của clen, sal trên TACN, thịt và gan heo được xác định dựa trên
đường chuẩn của tỉ lệ diện tích ion chuẩn và nội chuẩn theo nồng độ của clen và sal trên các
nền mẫu.Hiệu suất thu hồi của phương pháp (H
PP
), với việc sử dụng nội chuẩn đồng vị phải
đạt khoảng 100%. Có thể ước tính hiệu suất thu hồi thực trong tách chiết (H
T
) bằng cách
dựa trên đường chuẩn xây dựng từ các dung dịch chuẩn. Kết quả được trình bày trong các
bảng 3.24 ; 3.25 ; 3.26
Bảng 3.24
. Hiệu suất thu hồi của clen và sal trên nền thịt (m mẫu = 2g)
Clenbuterol Salbutamol
Co
mẫu
(
μg/Kg)
Co
Định mức
(nguyên tắc)
(
μg/Kg)
H
PP
TB
(%)

(3,32)
73,82
(4,51)
0,125 0,25
97,26
(1,42)
71,39
(3,03)
2 4,0
97,52
(2.72)
76,42
(4,29)
0,5 1
96,59
(1,78)
77,37
(2,90)
5 10
99,70
(1,61)
83,59
(1,71)
10 20
100,14
(0,3)
83,85
(0,50)
25 50
97,98

ắ
c) (μg/Kg)
H
PP
TB
(%)
(RSD%)
H
T
TB
(%)
(RSD%)
Co
mẫu
(ng/mL)
Co
Định mức
(nguyên tắc)
(n
g
/mL)
H
PP
TB
(%)
(RSD%)
H
T
TB
(%)

(0,58)
83,01
(2,14)
50 100
100,11
(6,34)
84,78 (4,13)
50 100
98,12
(0,96)
84,73
(4,07)
75 150
99,85
(2,40)
85,59 (2,10

Bảng 3.26
. Hiệu suất thu hồi của clen và sal trên nền gan (m mẫu = 2g
Clenbuterol Salbutamol
Co
mẫu
(
μg/Kg)
Co
Định mức
(nguyên tắc)
(
μg/Kg)
H

(5,42)
0,5 1
100,57
(0,96)
70,17 (1,57)
5 10
100,01
(1,67)
81,21
(2,20)
10 20 98,64
(1,95)
81,91 (4,05)
10 20
100,73
(3,01)
82,15
(0,55)
25 50
100,13
(3,88)
82,21 (3,53)
25 50
98,94
(1,35)
82,56
(1,86)
50 100
99,84
(6,94)

Cmẫu
(μg/Kg)
Co
(μg/Kg)
LOD (RSD%) (μg/Kg)
n = 6
LOQ (
μg/Kg) (RSD%)
clen sal clen sal
Thịt (2g)
0,0991 0,0495
0,017 (14,14) 0,026 (14,36) 0,051 (14,14) 0,078 (14,36)
TACN (2g) 0,396 0,198 0,074 (9,82) 0,084 (9,4) 0,22 (9,82) 0,248 (9,4)

Kết quả cho thấy giá trị LOD của clen rất nhỏ đáp ứng được tiêu chuẩn của Châu Âu, Codex
và phù hợp với quy định Việt Nam.
3.4. Độ dao động của tỷ lệ cường độ các mảnh ion

Bảng 3.31.
Tỉ lệ cường độ ion phụ và ion chính của clen và sal trên dung dịch chuẩn
Clen
Co
(μ
g
/L)
0,0495 0,495 0,991 1,985 9,91 99,10
A
132
,
10

Dao động cho phép 22,63- 36,63 %
Sal
Co
((μg/L)
0,0776 0,776 1,552 15,52 77,63 155,25
A
166,01
/A
148,10
(%) 30,07 31,73 28,73 30,65 31,47 28,89
Dao động cho phép 21,10 -35,10%

Bảng 3.33.
Tỉ lệ ion phụ và ion chính của clen và sal trên nền mẫu TACN
Clen
Co
(μg/L)
0,0495 0,495 0,991 9,91 24,75 99,1
A
132
,
10
/A
203
,
01
(%) 29,20 31,10 30,63 29,28 31,43 28,46
Dao đ
ộ
n


Chỉ tiêu n
g
hiên cứu
0 ppb 400 ppb 600 ppb 1000 ppb P SEM
Khối lượng gà đầu TN(g) 665 825 742 730 0,98 17,08
Khối lư
ợ
n
g

g
à cuối TN(
g
)
1032 1266 1214 1250 0,02 21,50
Tăng trọng kỳ TN(g)
367
a
428
b
472
c
520
d
<0,01 7,43
Tiêu tốn thức ăn (g)
1562 1569 1607 1578 0,18 26,77
Hệ số chuyển hóa thức ăn
4,26

Bảng 3.51
Bảng tổng kết dư lượng clen và sal trong thịt, gan, thận gà sau thí nghiệm.
Nghiệm thức Hợp chất Hàm lượng chất
phân tích gà ăn (ng)
Nồng độ clen và sal tích lũy
(μg/Kg) (ppb)
Th
ị
tGan Th
ậ
n
A (Đối
chứng)
Clen
0 0 0 0
Sal
0 0 0 0
B (200ppb)
Clen
313800 0,146 50,69 61,83
Sal 313800 0,20 47,75 52,14
C (300ppb)
Clen
482100 117,43 128,55 132,51
Sal
482100 78,05 111,91 119,66
D (500ppb) Clen
789000 215,45 246,29 254,42
Sal 789000 158,45 175,92 185,29
Trang 21

Nghiệm thức bổ
sun
g
sal (500
pp
b)
Ghi chú

P1 P2 P3 P4 P5
P1.
Heo đối
chứng
P2, P3: Heo ăn
TA có chứa
500ppb clen
P4, P5: Heo ăn
TA có chứa
500ppb sal

Khối lượng heo đầu TN (Kg) 18,63 18,57 16,56 16,8 17,48
Khối lượng heo cuối TN(Kg) 65,84 100,8 112,79 115,41 114,69
Tăn
g
t
r
ọn
g
k
ỳ
TN (K

Đối chứng 0 0 0 0
500
pp
b (Clen)
88925 178,06
a
233,26
b
243,23
b
< 0,01 26,1
500 ppb (Sal)
85750 189,65
a
229,24
b
238,20
b
<0,01 29,5
Các chỉ số a, b biểu hiện sự khác nhau có ý nghĩa trong phân tích
Trang 22
Nhận xét: Bảng 3.55 cho thấy dư lượng clen và sal trong các mẫu thận, gan luôn cao hơn
trong các mẫu thịt (sự khác nhau có ý nghĩa trong phân tích phương sai P< 0,01). Các số
liệu trên nằm trong khoảng nhiễm sal và clen thực tế trong thịt heo đo được trong các mẫu
lấy trong 3 năm 2007-2009.
Như vậy trong cả gà và heo, nồng độ clen và sal tồn lưu trong thịt, gan, thận là rất
lớn (đối với clen vượt xa mức cho phép theo tiêu chuẩn của Châu âu hay Codex). Quyết
định của Việt Nam cấm s
ử dụng sal, clen trong thức ăn chăn nuôi là hoàn toàn hợp l ý.


6 CG 30 9 30,00 198-354 14 46,67 156-427
7 TAS80 21 8 38,10 125-315 kph kph kph
8 ST 30 8 26,67 111-379 kph kph kph
9 ADBC 21 7 33,33 201-481 9 42,86 97-196
10 ODBAS 39 11 28,21 153-724 kph kph kph
11 TT11C30
30 10
33,33 247-709 kph kph kph
12 TATNB 21 9 42,86 328-510 8 38,10 376-512
13 TĐĐ
30 10
33,33 264-526 kph kph kph
14 CT 21 kph kph Kph kph kph kph
T
ổ
n
g

393 106 26,97 111-1257 58 14,76 97-512

Nhận xét: Ở thời điểm từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 12 năm 2007 các mẫu TACN
chủ yếu bị nhiễm sal. Từ tháng 2 năm 2008 đến tháng 10 năm 2008 số mẫu TACN bị nhiễm
clen nhiều hơn, từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 12 năm 2009 số mẫu bị nhiễm sal nhiều
hơn và không có mẫu nào vừa bị nhiễm cả sal và clen. 3.7.2. Kết quả điều tra clen, sal trong thịt heo, thịt gà: Từ tháng 7/2007 đến 12/2009, qua
phân tích 1377 mẫu TACN, kết quả ghi nhận bảng 3.57
và 2008
- Số mẫu thịt heo nhiễm nồng độ clen có nồng độ cao và chiếm tỉ lệ lớn tập trung ở một
số chợ địa phương thuộc tỉnh Hậu Giang
3.7.2. Kết quả
điều tra clen, sal trong TACN, thịt heo và thịt gà trong năm 2010 và hai
tháng đầu năm 2011
Số mẫu hịt và TACN phân tích với kết quả như sau.

Bảng 3.58. Kết quả điều tra hàm lượng clen và sal trong TACN, thịt heo và thịt gà năm
2010- 2011
Năm Lo
ạ
i mẫu Tổn
g
số mẫu Nhiễm clenbuterol (
pp
b)
N
hiễm salbutamol (
pp
b)
2010
(64 mẫu)
Thịt
28
5
(1,36- 6,12) 7 (2,65-138)
TACN
36
5 (1,36- 2,38) 11 (1,41-1145)

) cho kết quả chính
xác, độ tin cậy cao, Qui trình đã đạt tiêu chuẩn phân tích theo yêu cầu của Châu Âu, với
các giá trị đạt được như sau:
- Hiệu suất thu hồi của phương pháp (H
PP
%) khoảng 100% và quy trình được sử
dụng để định lượng chính xác nồng độ clen và sal trong thịt, gan, thận và thức ăn
chăn nuôi.
- Hiệu suất thu hồi thực (H
T
%) từ tách chiết:
• Đối với clenbuterol: mẫu có nồng độ 0,05–50(μg/Kg), H
T
% : 68,5– 86,78%
• Đối với salbutamol: mẫu có nồng độ 0,8 –75 (μg/Kg), H
T
% : 70,91– 85,59%
- Giới hạn phát hiện (LOD) khá thấp cho cả clen và sal:
• LOD
clen
= 0,017 μ/kg; LOD
sal
= 0,026 μ/kg (với thịt heo)
• LOD
clen
= 0,074 μ/kg ; LOD
sal
= 0,084 μ/kg (với TACN)

Các trị số LOD