1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
[\
BÀI BÁO CÁO
Chủ đề 27:
CÂY SINH DÒNG VIRUS PRRS Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện:
TS.NGUYỄN NGỌC HẢI LUYỆN THỊ NGÂN
Lớp: DH06SH
MSSV: 06126089 -Năm 1987 bệnh được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ
, vào thời điểm đó, do chưa xác định được căn nguyên
bệnh nên được gọi là “bệnh bí hiểm ở lợn” (MDS).
Khi bị virus phá hủy, đại
thực bào không còn các
"chân giả", mất khả năng bắt
giữ và tiêu diệt tác nhân gây
bệnh (Nguồn Boehringer
Ingelheim Vetmedica
GmbH)
Các đại thực bào với các "chân giả" có tác
dụng bắt giữ các tác nhân gây bệnh và như
vi khuẩn, virus tiêu diệt chúng (Nguồn
Boehringer Ingelheim
Vetmedica GmbH)
3

-Tháng 1 năm 1991 ở Tây Ban Nha phát hiện trường hợp lâm sàng đầu
tiên trên đàn heo nhập khẩu. Ở Hà Lan bệnh cũng được báo cáo.
-Tháng 3 năm 1991 ở Bỉ cũng xuất hiện bệnh.
-Tháng 5 năm 1991ở An ghi nhận những trường hợp đầu tiên.
-Tháng 10 năm 1991 ở Pháp, những trận dịch đầu tiên xảy ra ở

hydro của lactate ( lactate dehydrogenase elevating virus-LDV) ở chuột và
virus gây sốt xuất huyết ở khỉ (simian hemorrhagic fever virus-SHFV).
Theo nguyên tắc dựa trên những đặc tính chung này , virus PRRS, EVA
và SHFV được xếp chung cùng một nhóm mới thuộc chi Arterivirus , họ
Arrterividae , bộ Nidovirales.
-Virus PRRS có vỏ bọc với đường kính 50-60 nm, b
ề mặt khá nhẵn và
có lõi nucleocapsid hình khối với đường kính 25-35 nm.
4 Hình 1: Hình bộ gen của PRRSV
II.1.3. Tổ chức gen virus PRRS
-Bộ gen của vius PRRS tương tự với những Arterivirus khác. Virion
chứa acid nhân RNA 15.1kb, dạng thẳng, một sợi, poly adeny (PolA) ở
đầu dương.
-Bộ gen chứa tám vùng đọc mở mã hóa cho những protein đặc hiệu
của virus. ORF1a và ORF1b chiếm 12kb. Ở đầu 5’ của gen mã hóa cho

PCR được thực hiện trên c
ơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ
nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau :
Bước 1: Biến tính (Denature)
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 - 95
o
C) trong vòng
30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách hoàn toàn thành
2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự
tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
6

Bước 2: Bắt cặp (Annealing)
Phản ứng của primer tác động lên dây nền, các primer này gắn vào đầu
dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template để có phân tử
DNA mới.
Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp đến mức cho phép các primer
bắt cặp được với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 – 70
o
C,
kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng
chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng.
Bước 3: Kéo dài (Extension)
Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ - 3’ của 2
primer nhờ hoạt động của polymerase. Nhiệt độ được tăng lên 72
o
C giúp
cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy
thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây
đến vài phút.

kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ
được khuế
ch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase.
II.3. Nguyên lý chung của phương pháp RT-PCR
Về nguyên lý, kỹ thuật RT-PCR cũng giống như kỹ thuật PCR thông
thường nhưng nhằm mục đích khuếch đại đoạn gen từ khuôn RNA thay vì
DNA. Trong kỹ thuật này có hai giai đoạn khuếch đại được thực hiện: giai
đoạn đầu là quá trình tổng hợp đoạn cDNA từ khuôn mẫu sợi RNA và giai
đoạn sau là quá trình tổng hợp DNA từ khuôn mẫu sợi cDNA vừa được
tổng hợp.
Khác v
ới kỹ thuật PCR chỉ sử dụng một enzym tổng hợp chuỗi
oligonucleotide, trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của hai loại
enzym tổng hợp chuỗi oligonucleotide: enzym phiên mã ngược và enzym
tổng hợp chuỗi oligonucleotide. Do enzym reverse transcriptase chịu nhiệt
kém nên quá trình phiên mã ngược đẻ tổng hợp cDNA thường phải thực
hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-45
o
C).
II.4.Nguyên lý chung của phương pháp nested PCR
8

Kỹ thuật nPCR được phát triển nhằm mục đích gia tăng độ nhạy và độ
đặc hiệu của phản ứng PCR. Trong kỹ thuật này, có hai cặp primer khác
nhau được sử dụng nhưng chỉ để nhằm khuếch đại đặc hiệu một đoạn gen
và phản ứng PCR phải thực hiện hai lần. Lần đầu, phản ứng PCR được
thực hiện trong 15-30 chu kỳ, với cặ
p mồi thứ nhất. Cặp mồi thứ nhất, ở
lần chạy PCR thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần
xác định và đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại

một ống đặc biệt cho ORF5 của EU-PRRSV
III.2.Thực hiện phản ứng RT-nPCR của ORF5
Bước 1:
5 µl trehalose 22 % được sử dụng để bảo quản và duy trì hỗn hợp bên
dưới trong dung dịch của các ống Eppendorf 0.2 ml: 20pmol cho mỗi mồi
trong (inners)
ORF5F(5'ATGAGATGTTCTCACAAATTGGGGCG3') và
ORF5R(5'CTAGGCCTCCCATTGCTCAGCCGAAGT3') (Suarez et al.,
1996 )
1 µl dNTPs (10 mM)
.25 µl Taq Polymerase (1·25 U, Fermentas, Vilnius, Lithuania).
-Để bảo quản thì các ống được sấy khô khoảng 2h nhiệt độ phòng.
Bước 2
-Tiến hành phản ứng RT-PCR trong đáy ống chứa chất được làm khô,
sử dụng chất phản ứng được x
ử lý trehalose trong nắp ống Eppendorf. Sự
khuếch đại được thực hiện trong 50 µl thể tích có chứa:
5 µl RNA và những chất phản ứng sau:
10

5 µl 10x PCR buffer [100 mM Tris–HCl (pH 8·8)
500 mM KCl], 0·8% Nonidet P40 (Fermentas)
5 µl MgCl2 (25 mM, Fermentas)
2 µl dNTPs (10 mM, Sigma)
5 pmol cho mỗi mồi outer EUORF5B
(5' CAATGAGGTGGGCIACAACC 3') và EUORF5C (5'
TATGTIATGCTAAAGGCTAGCAC 3') (Oleksiewicz et al., 1998 )
1 µl 10% Triton X-100 (Sigma)
0·5 µl (2·5 U) Taq DNA polymerase (Fermentas)
0·25 µl (10 U) RNasin (Promega)

hexanucleotide ngẫu nhiên(100ng).
11

-Dầu khoáng được thêm vào để hoạt động như một vật cản hơi nước.
-Để tiến hành phiên mã ngược, hỗn hợp được ủ ở 37
0
C trong 10 phút.
-5 µl cDNA tổng số được khuếch đại bằng phản ứng RT-PCR trong
thể tích 50 µl : 28.8 µl nước, 10 µl 5x dung dịch đệm phản ứng Taq
polymerase, 5 µl 25 mM MgCl2, 4 µl dNTPs, 1 U Taq Polymerase
(Fermentas) và 20 pmol của mỗi primer:
5' GCCCCTGCCCAICACG 3' và
5' TCGCCCTAATTGAATAGGTGA 3' (Oleksiewicz et al., 1998).
-Chu trình nhiệt được thực hiện trong 35 chu kì với chu trình nhiệt sau:
94
o
C trong 15 giây
52
o
C trong 30 giây
72
o
C trong 30 giây
-Một bước kéo dài ở 72
o
C trong 10 phút hoàn thành quá trình
khuếch đại. Kích thước mong chờ của ORF7 khuếch đại là 637 bp.
III.4.Phân tích trình tự nucleotide
Để giải trình tự,những sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agar
1.5%. Sau đó nhuộm ethidium bromide và khử muối trong nước siêu

thay thế cho mỗi vị trí, giữa cặp trình t
ự. Những sự tính toán DNADIST
được dựa vào mô hình thay thế F48, đồng hóa và dị hoá xuất hiện những
tỉ lệ khác nhau. Dựa vào khoảng cách chất nền (matrix), cây sinh dòng
được xây dựng phù hợp với phương pháp Fitch-Margoliash, dùng chương
trình DNADIST của gói PHYLIP.Độ tin cậy của việc lấy mẫu được thực
hiện trong 100 bản sao bộ dữ liệu để đánh giá những giới hạn tin cậy của
mô hình nhánh.
IV. Kết quả
IV.1.Cơ sở địa lý cho sự đa dạng của PRRSV ở Châu
Âu.
-Tổng số 22 trình tự ORF5 không hoàn chỉnh đại diện cho dòng
PRRSV gây bệnh đã được xác định: 15 từ Ba Lan, 2 từ Đức, 1 từ Anh và
4 từ Lithuania. Hơn nữa, hiện nay hai vaccin nhược độc chủng Châu Âu
có thể được dùng , Porcilis PRRS (Porcilis PRRS > 86-98%,) và Pyrsvac-
183 đã được giải trình tự. Dựa vào 24 trình tự mới ORF5, và những trình
tự ORF5 chủng Châu Âu được chọn lọc có sẵn trong ngân hàng gen, một
cây sinh dòng được xây dựng. Cây sinh dòng cho thấy một nhóm kín của
những trình tự từ Netherland, Anh, Pháp và Belgium g
ần trình tự ORF5
Lelystad nguyên thủy. Nó đại diện một dòng của Hà Lan phân lập từ năm
1991. Tất cả những trình tự trong nhóm kín giống Lelystad (Lelystad-like)
thì có thể từ năm 1991-1992. Một vài nhóm nhỏ khác trong cây sinh dòng
có thể được giải thích bởi dịch tể học:
Ví dụ: PL9 và PL11 từ những nông trại có sự trao đổi những con heo.
LT2 và LT4 từ hai nông trại gần nhau về mặt địa lý.
PL2,PL7 và PL15 từ một nông trại nhưng khác biệt về thời gian.
-Một vài nhóm không có sự giải thích rõ ràng về mặt địa lý cũng
không về mặt thời gian cũng như về mặt dịch tễ học.
Ví dụ: nhóm có chứa ES1 (Tây Ban Nha, 1992) và PL12 (Ba Lan,

thích bằng sự tiến hóa của một tổ tiên chung PRRS dòng Châu Âu sau
dịch bệnh bùng nổ.Nh
ững PRRS phân lập rất khác nhau có sự xuất hiện
độc lập nhưng phần lớn xuất hiện đồng thời ở các nước Châu Âu khác
nhau.
(hình 1: so sánh NL1, ES1, ES2, DK1, IT1, tất cả từ năm 1991-1992,
PL1 và PL2 từ năm 1994).
IV.2.Trình tự PRRS của Lithuania đa dạng khác
thường.
-Dựa vào hình thức phân tích đơn giản nhất, việc xem xét tỉ lệ
nucleotide giống nhau từ hai trình tự Châu Âu khác biệt nhất trong bộ dữ
liệu là ‘Nie’ từ Ba Lan-PL9 và ‘Aus’ từ Lithuania-LT1. ‘Nie’ và ‘Aus’ đã
cho thấy chỉ có 71.5% nucleotide giống nhau giữa chúng. Ngoại trừ trình
tự Polish và Lithuania từ bộ dữ liệu, những trình tự Châu Âu khác biệt
nhất là ‘2156’ (IT1’ và ‘Olot/91’ (ES1), chúng có 82.4% nucleotide giống
nhau . Do đó, những trình tự Polish và Lithuania đã mở ra hiểu biết về
vùng đa dạng củ
a PRRS chủng Châu Âu.
-Khi việc phân tích bị giới hạn bởi những trình tự từ năm 2000, hai
trình tự khác biệt nhất trong bộ dữ liệu là ‘Sid’ từ Lithuanian và ‘Krz’ từ
Ba Lan (LT2 và LT3). ‘Sid’ và ‘Krz’đã cho thấy chỉ có 72.2% nucleic
acid giống nhau giữa chúng. Tuy nhiên, những trình tự Lithuania dường
như khác so với trình tự của kiểu gen Châu Âu khác đã ghi nhận trước đó
( LT1-LT4) . Xa hơn, sự đa dạng cao giữa những trình tự Lithuanian như
giữa vài trình tự Châu Âu khác.

IV.3.Dấu vết phân tích trình tự tổ tiên chung cho kiểu
gen Châu Âu và Châu Mỹ.
-Để thấy được những trình tự khác biệt nhất như thế nào từ Lithuanian
được đặt trong phả hệ EU-US PRRSV, một cây sinh dòng mới được xây

V.Thảo luận:
-Từ khi dịch bệnh bùng nổ trong những năm sau thập niên 80, PPRSV
vẫn tiếp tục là nguyên nhân chính gây thiệt hại kinh tế ở các nông trại heo.
18

Ở Bắc Mỹ, sự bùng nổ dịch bệnh gần đây của PRRSV không điển hình đã
đề nghị trách nhiệm với sự bùng nổ của các dòng PRRS mới , việc chống
lại các vaccin hiện nay dường như không cung cấp sự bảo hộ . Về mặt lý
thuyết, viễn cảnh này không bị giới hạn ở Bắc Mỹ, và kiến thức về đa
dạng di truyền của EU-PRRSV có th
ể cải thiện điều kiện đánh giá các
trường hợp tương tự có khả năng xảy ra ở Châu Âu. Dự đoán bao gồm cả
các nước Đông Âu trong cộng đồng Châu Âu có sự liên quan một cách
đặc biệt trong khía cạnh này, vì dữ liệu có giá trị đưa ra giả thiết rằng Nga
và Cộng Hòa Séc có thể có các chủng PRRSV mà có sự khác biệt so với
những phát hiện đó ở các nước Châu Âu khác. Cho đến bây giờ hay lúc
đ
ó, số lượng những trình tự được ghi nhận từ Cộng Hòa Séc có sự liên hệ
thấp với các trình tự của Nga nên sự hiểu biết của chúng tôi vẫn chưa đưa
vào cơ sở dữ liệu chung. Vì thế, nghiên cứu hiện nay đã đảm bảo khám
phá xa hơn về đa dạng trình tự của PRRSV ở Đông Âu bằng việc phân
tích các trình tự của PRRSV đầu tiên từ Ba Lan và Lithuania.
Khám phá chính trong nghiên cứu hiện tạ
i là Lithuania có dòng
PRRSV đa dạng khác thường. Tất cả bốn trình tự trong huyết thanh heo
của Lithuania được lấy từ sản phẩm RT-PCR. Theo ý kiến của chúng tôi,
điều này làm nó giống các trình tự của Lithuania được lấy từ toàn bộ
virion của PRRSV. Chúng tôi lấy những trình tự của virus trực tiếp từ
trình tự cả hai sợi của sản phẩm PCR không tạo dòng để giảm tối thiểu
việc tạo Taq nhân tạo. Tuy nhiên, do có sự

đoạn từ năm 1991 (virus Lelystad phân lập là PRRSV phân lập đầu tiên)
đến nay. Rõ ràng, đi
ều này không thể thực hiện. Do đó, việc mô tả đúng
về đa dạng trình tự của EU-PRRSV sẽ có thể phát triển dần dần, do có
liên tiếp nhiều nghiên cứu bổ sung. Nghiên cứu hiện nay về tính đa dạng
chủ yếu ở Châu Âu, dòng PRRSV của chủng Châu Âu đã bổ sung vào
tính đa dạng của EU-PRRSV trong nghiên cứu trước đó (Suarez et al.,
1996 ; Oleksiewicz et al., 2000 ; Indik et al., 2000 ; Forsberg et al., 2001 ,
2002 ). Hướng mô tả dường như cho thấy các dòng PRRS thay đổi khác
nhau không thể là mộ
t đặc trưng riêng biệt ở bất kì một quốc gia nào,
nhưng là một quy luật chung ở Châu Âu, ngoại trừ các nước như là Hà
Lan, Belgium, Pháp và Anh nơi hiện diện của nhiều dòng PRRSV có quan
hệ gần gũi ( Lelystad-like) có thể được giải thích bằng con đường
thương mại. Figure 5 Sequence alignment of Lelystad Virus và
Porcilis®PRRS

VI. Kết luận
Sự đa dạng của PRRSV ở Châu Âu do nhiều nguyên nhân:
- Sự tiến hóa của một tổ tiên chung PRRS dòng Châu Âu sau dịch
bệnh bùng nổ.
-Một vài nhóm có thể được giải thích bằng dịch tể học và về mặt địa
lý.
-Có sự đa dạng lớn giữa các trình tự của Lithuania.
21
Mục lục:

I.Đặt vấn đề 3
II. Tổng quan 3
II.1.Giới thiệu về virus PRRS 3
II.1.1. Lịch sử phát hiện virus PRRS 3
II.1.2. Kích thước và hình thái học virus PRRS. 5
II.1.3. Tổ chức gen virus PRRS 6
II.2 Nguyên lý chung của phương pháp PCR 6
II.3. Nguyên lý chung của phương pháp RT-PCR 8
II.4.Nguyên lý chung của phương pháp nested PCR 9
II.5. Nguyên lý cơ bản của phương pháp RT-nPCR một ống 10