25
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN

1) Nguyễn Quang Huy, Phạm Thanh Nga, Phan Tuấn Nghĩa, 2005. Tìm hiểu
tác dụng chống sâu răng của dịch chiết vỏ cây Sao Đen (Hopea odorata
Roxb). Tạp chí Dược học 45 (350): 13-19.
2) Nguyen Quang Huy, Pham Anh Thuy Duong, Phan Tuan Nghia, 2005.
Inhibition of acid production by Streptococcus mutans of some medicinal
plant extracts. Tạp chí Khoa học 21(2): 161-168.
3) Nguyen Quang Huy, Pham Anh Thuy Duong, Phan Tuan Nghia, 2006,
Antibacterial activity of some medicinal plants against dental caries
pathogen Streptococcus mutans. The first international conference on
science and technology for sustainable development of the greater Mekong
Sub-region, Khon Kaen, Thailand p. 10
4) Nguyen Quang Huy, Phung Thi Thu Huong, Pham Anh Thuy Duong, Phan
Tuan Nghia, 2006. Inhibitory effects of Syzygium resinogsum Gagnep
extracts on caries-inducing properties of Streptococcus mutans. Tạp chí
Khoa học 22 (4): 131-136.
5) Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Văn Quang, Phan Văn
Kiệm, 2007. Các oligostilben từ vỏ cây sao đen Hopea odorata Roxb. Tạp
chí Dược học 47 (372):37-39.
6) Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Văn Quang, Phan Văn
Kiệm, 2007. Axít asiatic từ cây sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep và
tác dụng của nó lên vi khuẩn Streptococcus mutans. Tạp chí Dược học 47
(375):19-22.
7) Nguyễn Quang Huy, Phùng Thị Thu Hường, Phan Tuấn Nghĩa, 2007. Phân
lập và nhận dạng một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ người Việt
Nam. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 291-297.

Hà Nội, 2009 27
Công trình này được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học
1. PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
2. TS. Dương Văn Hợp

Phản biện
1.
2.
3.
Luận án sẽ được bảo vệ trước hội đồng cấp nhà nước chấm luận án tiến sĩ họp tại
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội.

Vào hồi giờ ngày tháng năm 2009

Có thể tìm luận án tại
mới, có thể thay thế một phần fluo mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao. Hiện
nay, việc tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có tác dụng bảo vệ răng miệng đang
là xu hướng được quan tâm nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn.
Việt Nam có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó rất nhiều
loài có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Từ ngàn xưa, cộng đồng các
dân tộc trên đất nước ta đã có truyền thống sử dụng cây cỏ để chữa bệnh, bảo vệ
sức khỏe chống lại bệnh tật trong đó có bệnh sâu răng (Đỗ Huy Bích và tập thể, 2

2004; Đỗ Tất Lợi, 2001; Lã Đình Mỡi và tập thể, 2001). Tuy nhiên, đến nay việc
tìm kiếm các hợp chất mới chưa mang lại nhiều kết quả như mong muốn. Hơn
nữa, các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của các hợp chất thứ cấp từ thực vật
lên vi khuẩn sâu răng hiện vẫn còn thiếu.
Đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi
khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans” của chúng tôi nằm trong xu thế
nghiên cứu chung của thế giới và Việt Nam.Việc tiến hành đề tài này là cần thiết
và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các
bệnh về răng, miệng đặc biệt là bệnh sâu răng.
Mục tiêu: Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là điều tra tác dụng chống sâu răng
của dịch chiết một số loài thực vật ở Việt Nam thông qua việc nghiên cứu ảnh
hưởng của chúng lên các quá trình sinh lý, hoá sinh, một số enzyme và hệ
enzyme có liên quan của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans, từ đó
nghiên cứu cách tách chiết, tinh sạch một vài hợp chất thứ cấp từ thực vật và đi
sâu tìm hiểu tác dụng chống sâu răng của chúng.
Nội dung nghiên cứu
• Nghiên cứu điều tra ảnh hưởng một số dịch chiết thực vật lên quá trình
sinh axit gây sâu răng của Streptococcus mutans và tác dụng giết chết vi
khuẩn này của các dịch chiết.

• Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu phân lập và nhận dạng đến loài một
số chủng vi khuẩn S. mutans từ người Việt Nam.
Bố cục của luận án:
Luận án gồm 136 trang, 10 bảng số liệu, 47 hình, 209 tài liệu tham khảo
tiếng Việt và tiếng Anh. Bố cục luận án gồm: mở đầu (3 trang), tổng quan tài
liệu (36 trang), nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), kết quả
nghiên cứu và bàn luận (59 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), tài liệu tham
khảo (21 trang) và phần phụ lục.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan
Sâu răng là bệnh gây ra bởi vi khuẩn trên mảng bám răng, điển hình là
Streptococcus mutans. Những vi khuẩn này sử dụng các carbohydrate, chủ yếu là
đường glucose để lên men tạo ra axit lactic. S. mutans có thể tồn tại và sinh
trưởng trong môi trường pH thấp, có thể duy trì hoạt động trao đổi chất mạnh và
tạo ra axit. Axit hình thành sẽ gây ra sự hòa tan các khoáng chất có trong men
răng vốn được cấu tạo bởi hydroxylapatide liên kết với ion canxi tích điện dương 4

và ion phosphate tích điện âm, dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành các hố trên
răng và gây ra sâu răng (Gibbons và Van, 1975; Nguyễn Dương Hồng, 1997).
Mặt khác, trên răng các vi khuẩn trong khoang miệng và sản phẩm của
chúng cùng với những mảnh vụn thức ăn tạo thành mảng bám răng. Mảng bám
răng không chỉ là nguyên nhân gây ra sâu răng mà còn là một yếu tố chủ yếu gây
bệnh nha chu (Kolenbrander, 2000).
Bệnh sâu răng là một trong 3 bệnh được tổ chức Sức khỏe thế giới (WHO)
khuyến cáo về mức độ nguy hiểm chỉ đứng sau bệnh tim mạch và ung thư. Trong
các thập niên trước, tỷ lệ người mắc bệnh sâu răng khá cao đặc biệt ở trẻ em.

khuẩn này luôn được phát hiện trong nước bọt, mảng bám răng của người và có
số lượng rất cao ở những vùng răng bị sâu. Đặc trưng gây sâu răng của S. mutans
chính là khả năng sinh axit mạnh và chịu axit tốt của vi khuẩn này, cho nên trong
môi trường có đường, S. mutans tạo ra axit làm tan men răng dẫn đến sâu răng.
Khả năng thích nghi hay chịu axit của S. mutans liên quan đến nhiều cơ chế
khác nhau, quan trọng nhất là hoạt động của các bơm proton, đặc biệt là F-
ATPase, nhằm bơm proton ra ngoài, duy trì pH nội sinh (pHi) luôn cao hơn so
với pH môi trường. F-ATPase của S. mutans được phát hiện là có sự thay đổi
trong cấu trúc để thích nghi hoạt động tốt ở pH thấp (Sturr và Marquis, 1992).
Ngoài ra, S. mutans còn có một số cơ chế thích nghi axit khác như: tăng cường
tổng hợp các chaperonin hỗ trợ sự hình thành cấu trúc không gian đúng của các
protein (Jayaraman và tập thể, 1997), tăng cường sinh tổng hợp các enzyme sửa
chữa ADN bị tổn thương do axit (Haln và tập thể, 1999) hay
thay đổi thành phần
lipid của màng tế bào để làm giảm khả năng thấm proton (Quivey và tập thể,
2000) Nhờ vậy, S. mutans vẫn có thể tồn tại và sinh axit khi pH môi trường
giảm xuống dưới 4.
Hơn nữa S. mutans cũng có các đặc điểm để chống chịu các stress về oxy
hóa, để tồn tại và phát triển. Các vi khuẩn đường miệng sinh axit lactic thiếu các
cytochrome, các protein chứa nhân hem và enzyme catalase nhưng vẫn có thể
sinh trưởng trong môi trường có chứa các gốc oxy tự do vì chúng có hệ thống
các enzyme bảo vệ như NADH oxidase, Superoxide dismutase (Higuchi 1992,
1999).
Việc phân lập, phát hiện sự có mặt S. mutans đóng vai trò quan trọng trong
việc chẩn đoán và điều trị bệnh sâu răng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được
nghiên cứu, áp dụng trong phân lập và nhận dạng các chủng S. mutans ở người.
Gần đây kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) kết hợp kỹ 6

. Tác dụng sinh học của các hợp
chất thực vật thứ sinh rất đa dạng và phong phú. Một số hợp chất thực vật thứ
sinh được khai thác về tác dụng chống oxy hoá, tác dụng kháng khuẩn, chống 7
viêm và thậm chí ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, HIV (Park và tập
thể, 2006, Dai và tập thể, 1998). Chen và tập thể (1989) đã nghiên cứu tác dụng
của 79 dịch chiết thực vật lên vi khuẩn S. mutans và phát hiện 3 loài M.
australia, L. octovalvis và T. orientalis chứa các hợp chất có tính kháng S.
mutans cao nhất. Nhiều hợp chất nhóm flavonoid trong cây Erythirina variegata,
Ormosia monosperma được phát hiện có tác dụng giết nhiều loài vi khuẩn đường
miệng. Song và tập thể (2007) phát hiện thấy dịch chiết của cây Polygonum
cuspidatum có chứa các hợp chất thuộc nhóm terpenoid, phenolic, glycoside
không những có khả năng ức chế sự phát triển S. mutans mà còn ức chế sự hình
thành mảng bám răng. Vasconcelos và tập thể (2006) phát hiện thấy các hợp chất
từ dịch chiết cây xoài và cây neem có tác dụng ức chế sự phát triển các loài
nhóm Streptococcus như S. salivarius. S. mitis và S. sanguis. Gần đây ở Việt
Nam, Nguyễn Thị Mai Phương và tập thể (2005) đã phát hiện các chất
polyphenol trong vỏ cây măng cụt có tác dụng ức chế các enzyme của quá trình
đường phân của S. mutans. Nhìn chung, các nghiên cứu về hoạt tính kháng
khuẩn sâu răng của các hợp chất thực vật chưa đi sâu về cơ chế tác động của
chúng lên vi khuẩn gây sâu răng.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Chủng vi khuẩn S. mutans GS-5, S. sanguis NCTC-10904, S. gordonii
ATCC 10558, S. rattus FA-1 là quà tặng của giáo sư Robert E. Marquis, Đại học
Rochester, New York, Mỹ.
Các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân bị sâu răng người Việt Nam (để phân lập

2.2.7. Xác định khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn thông qua việc đếm
số CFU sau các khoảng thời gian khác nhau ở pH thấp.
2.2.8. Xác định mức độ tiêu thụ oxy của tế bào trong điều kiện dư thừa glucose
bằng điện cực oxy.
2.2.9. Xác định hoạt độ một số enzyme chính liên quan đến đặc trưng sinh axit
và chịu axit thông qua sự chuyển hóa của các chất đặc hiệu.
2.2.10. Xác định thành phần một số hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết thực
vật bằng các phản ứng đặc trưng.
2.2.11. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất bằng phân tích phổ cộng hưởng
từ hạt nhân (NMR) với sự giúp đỡ của Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên,
Viện Khoa học Việt Nam.
9
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có khả năng kháng khuẩn sâu răng
3.1.1. Khả năng ức chế của dịch chiết một số thực vật lên sự sinh axit của S.
mutans
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng 7 loài thực vật là: Chàm tía
Strobilanthes cusia B. (CTI), Hương nhu trắng Ocimum gratissimum L. (HNT),
Kim ngân Lonicera japonica T. (KNG), Quỷ trâm thảo Bidens pilosa L. (QCT),
Sài đất Verbesina calendulaceae L. (SDA), Sắn thuyền Syzygium resinosum G.
(STA) và Sao đen Hopea odorata R. (SDE). Cả 7 loài này đều là những cây
thuốc có khả năng chống viêm và được ứng dụng trong các bài thuốc dân gian để
chữa các bệnh có liên quan đến răng miệng (Đỗ Tất Lợi, 2001; Đỗ Huy Bích và
tập thể, 2001). Bộ phận được sử dụng để thu dịch chiết là lá, riêng với Sao đen
bộ phận sử dụng là vỏ.
Cơ chế gây bệnh sâu răng của S. mutans là do tác dụng làm mòn men răng
bởi axit được vi khuẩn sinh ra trong quá trình phân giải đường. Do vậy, để xác

5,24 ± 0,16 4,36 ± 0.20
3 Hương nhu trắng
4,92 ± 0,26 4,25 ± 0,08
4 Kim ngân
5,37 ± 0,20 4,98 ± 0,13
5 Quỷ châm thảo
5,20 ± 0,07 4,36 ± 0,08
6 Sài đất
4,76 ± 0,39 4,56 ± 0,14
7 Sao đen
6,83 ± 0.06 5,12 ± 0,09
8 Sắn thuyền
6,51 ± 0,19 5,02 ± 0,05
Các giá trị sau ± là giá trị SD với n =5
3.1.2. Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 bởi các dịch chiết thực vật
Kết quả thí nghiệm diệt khuẩn S. mutans GS-5 ở pH 4 (hình 3.5) và pH 7
(hình 3.6) cho thấy ở nồng độ 10%, dịch chiết cả 7 loài thực vật trong nghiên
cứu đều có tác dụng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 ở các mức khác nhau. Trong
đó dịch chiết KNG, SDE và STH có tác dụng cao hơn so với các dịch chiết còn
lại, và tác dụng này ở pH 4 cao hơn ở pH 7, thể hiện ở chỗ thời gian để 90%
quần thể tế bào bị tiêu diệt bởi dịch chiết ứng với giá trị D từ 5 đến 7 phút trong
khi ở các mẫu dịch chiết khác giá trị D là trên 10 phút. Khả năng diệt S. mutans
GS-5 của các dịch chiết ở pH 4 cao hơn pH 7 là một điều khá thú vị vì đây là
một tác dụng mong muốn của các hợp chất chống sâu răng, bởi pH thấp (dưới 4)
mới có tác dụng bào mòn men răng dẫn đến sâu răng (Gibbons và Van, 1975).
-8
-6
-4
-2
0

bào trên biofilm nhận thấy sinh khối biofilm của mẫu thí nghiệm tăng lên ít hơn
so với mẫu đối chứng (bảng 3.3). Đặc biệt với mẫu xử lý bằng dịch chiết Sao đen
hay Sắn thuyền, lượng sinh khối tế bào tăng lên tương ứng 12,1% và 20,5% của
mẫu đối chứng (tức là sự hình thành biofilm đã bị ức chế tương ứng 87,9% và
79,5%). Đây là phát hiện có ý nghĩa thực tiễn, do có nhiều chất có tính kháng
khuẩn ở dạng huyền dịch nhưng không có tác dụng với các tế bào ở dạng biofilm
vì bị hạn chế về khả năng khuyếch tán và rất khó kiểm soát khi sử dụng các chất
kháng khuẩn thông thường như hiện nay.
Bảng 3.3. Tác dụng của dịch chiết thực vật lên sự hình thành biofilm ở S.
mutans GS-5
Mẫu Đối
chứng
CTI HNT KNG QCT SDA SDE STH
% sinh
khối tăng
100 65,8 78,9 54,1 60,8 48,2 12,1 20,5
% ức chế 0 34,2 21,1 45,9 39,2 51,8 87,9 79,5 12
3.1.4. Tác dụng của các dịch chiết thực vật phối hợp với fluo lên S. mutans GS-5
Trong các chất kháng khuẩn bảo vệ răng miệng, fluo được Tổ chức Y tế thế
giới khuyến cáo sử dụng do vừa có khả năng kháng khuẩn vừa có khả năng tái
tạo làm bền men răng. Florua natri (NaF) là thành phần chính được sử dụng
trong thuốc đánh răng hay nước súc miệng. Dựa trên các kết quả nghiên cứu
trước đây của Phan và tập thể (2001) về tác dụng của fluo, chúng tôi đã lựa chọn
và sử dụng các dịch chiết với nồng độ 10% phối hợp với NaF ở nồng độ 0,25
mM (thấp hơn nhiều lần nồng độ fluo được sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ
răng miệng thông thường).
Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy khi phối hợp các dịch chiết với NaF

2
lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
Giá trị pH cuối cùng Giá trị pH cuối cùng Mẫu
nghiên
cứu
Không bổ
sung NaF
Bổ sung NaF
0,25mM
Không bổ
sung H
2
O
2

Bổ sung H
2
O
2
0,3mM
Nước
4,08 ± 0,21 4,21 ± 0,02 4,08 ± 0,09 4,45 ± 0,16
Ethanol
4,11 ± 0,08 4,23 ± 0,09 4,30 ± 0,16 4,48 ± 0,12
CTI
5,41 ± 0,06 6,27 ± 0,09 5,29 ± 0,12 5,64 ± 0,12 13
HNT

log N /N o

-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 15 30 45 60
thêi gian ( phót)
L ogN/N o

-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 15 30 45 60
thêi gian ( phót)
L og N /No

Hình 3.11. Tác dụng diệt vi khuẩn của dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen
với S. gordonii ATCC-10558 (A), S. sanguis NCTC-10904 (B), S. rattus FA-1
(C). Đối chứng (), SDE (), STH (♦).
Ngoài ra, chúng tôi cũng còn phát hiện thấy dịch chiết SDE và STH có tác
dụng ức chế mạnh với sự tiêu thụ oxy của S. mutans GS-5 (dẫn liệu không trình
bày ở đây).


H
O
HO
H
H
HO
OH
OH
OH
HO
O
H
O
OH
H
H
OH
HO
H
1a
2a
3a
4a
5a
6a
7a
8a
9a
10a

13b'
14b'
1a'
2a'
3a'
4a'
5a'
6a'
7a'
8a'
9a'
10a'
11a'
12a'
13a'
14a'

H
OH
O
HO
H
O
HO
HO
OH
1
2
3
4


15
công thức phân tử C
56
H
42
O
12
, đây là một hợp chất đã được tách ra từ Hopea
paviflora (Tanaka và tập thể, 2000). Hợp chất SDE2 cũng có dạng phổ NMR
tương ứng với phổ của hợp chất malibatol A với công thức phân tử C
28
H
20
O
7
đã
được biết đến từ loài Hopea malibato. Hợp chất này có tác dụng ức chế sự phát
triển của dòng tế bào ung thư CEM-SS (Dai và tập thể, 1998). Đây là lần đầu
tiên hai hợpchất hopea phenol và malibatol A từ vỏ Sao đen được tinh sạch, tách
chiết tại Việt Nam.
3.2.3. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của hopea phenol và
malibatiol A từ vỏ Sao đen
3.2.3.1. Tác dụng của hopea phenol và malibatiol A lên sự sinh axit của S.
mutans GS-5
Khi bổ sung hopea phenol hoặc malibatiol A ở nồng độ 4 mM vào huyền
dịch S. mutans GS-5 trong điều kiện dư thừa glucose thì pH cuối cùng mẫu
tương ứng là 4,9 và 5,21, trong khi mẫu kiểm tra có pH là 4,1 (hình 3.15). Kết
quả này chứng tỏ cả hai chất đều ức chế sự sinh axit của S. mutans GS-5, tương
tự như của dịch chiết vỏ Sao đen ban đầu.

Thêi gian (phót)
log N/No

3.2.3.3.Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ ATPase của S.
mutans GS-5
Hoạt độ ATPase của S. mutans chủ yếu thuộc về F-ATPase. Enzyme này
định vị trên màng tế bào, có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển proton
qua màng, quyết định khả năng chịu axit của vi khuẩn này. Kết quả nghiên cứu
(hình 3.17) cho thấy hopea phenol và malibatol A đều ức chế hoạt độ ATPase
của S. mutans GS-5. Nồng độ hopea phenol và malibatol A gây ra ức chế 50%
hoạt độ ATPase tương ứng là 1,3 mM và 0,75 mM, chứng tỏ cả hai đều là những
chất ức chế mạnh của ATPase. Tác dụng ức chế ATPase của hopea phenol và
malibatol A giải thích được một phần tác dụng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 tại
pH axit của dịch chiết Sao đen.
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4
nång ®é (mM)
Ho¹t ®é cßn l¹i (%)

3.2.3.4. Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ enzyme
phosphoryl hoá đường (PTS) của Streptococcus mutans GS-5
Hình 3.16. Khả năng diệt S. mutans GS-5 tại
pH 4 của Hopea phenol và Malibatol A.
Đối chứng (), Hopea phenol 0,75 mM
(

Ho¹t ®é cßn l¹i (%)

3.2.3.5. Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ một số enzyme
khác của Streptococcus mutans GS-5.
Chúng tôi cũng đã tìm hiểu tác dụng của hopea phenol và malibatol A
lên hoạt độ của pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, NADH oxidase của S.
mutans GS-5 và phát hiện thấy rằng, cả hai hợp chất này đều ức chế hoạt độ của
các enzyme này. Nồng độ hopea phenol và malibatol A ức chế 50% hoạt độ
pyruvate kinase tương ứng là 2,2 mM và 2,5 mM. Nồng độ hopea phenol và
malibatol A ức chế 50% hoạt độ lactate dehydrogenase tương ứng là 2,3 mM và
2,5 mM. Nồng độ hopea phenol và malibatol A ức chế 50% hoạt độ NADH
oxidase tương ứng là 1,5 mM và 1 mM. Tác dụng ức chế PTS, pyruvate kinase,
lactate dehydrogenase bởi hopea phenol và malibatol A có thể là nguyên nhân
làm cho sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans GS-5 bị ức chế bởi các hợp chất này
cũng như bởi dịch chiết từ vỏ Sao đen. Còn tác dụng ức chế NADH oxidase của
hai hợp chất này góp phần làm rõ nguyên nhân ức chế tiêu thụ oxy bởi Sao đen.

3.3. Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một chất thứ cấp có hoạt tính
kháng khuẩn sâu răng từ cây Sắn thuyền
3.3.2. Tách, tinh sạch một chất thứ cấp từ lá cây Sắn thuyền
Để tách, tinh sạch một hợp chất thực vật thứ cấp từ lá Sắn thuyền chúng
tôi đã thực hiện theo quy trình tách chiết, tinh sạch hopea phenol và malibatol A
Hình 3.18. Ảnh hưởng của hopea phenol
và malibatol A lên hoạt độ PTS của S.
mutans GS-5. Hopea phenol (),
Malibatol A (). Ký hiệu (I) trong đồ thị
ch
ỉ giá trị SD với n = 3
.


11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
3
0Phổ NMR của ST3A từ lá Sắn thuyền giống với phổ của một hợp chất
triterpene có 5 vòng 6 cạnh với những tín hiệu của 30 cacbon trên phổ
13
C-NMR.
So sánh các kết quả phổ của ST3A với phổ tương ứng của asiaticoside cho thấy
có sự phù hợp hoàn toàn ở cả 29 vị trí cacbon và hợp chất ST3A được xác định
là axit asiatic với công thức phân tử là C

0
Thêi gian (phót)
Gi¸ trÞ pH

3.3.3.2. Tác dụng của axit asiatic lên sự diệt vi khuẩn S. mutans GS-5
Kết quả cho thấy axit asiatic từ lá Sắn thuyền có tác dụng diệt vi khuẩn S.
mutans GS-5 rất rõ rệt. Ở nồng độ 15 mM chỉ sau 15 phút tại pH 4 có tới 90% số
tế bào vi khuẩn S. mutans GS-5 bị tiêu diệt (hình 3.27).
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 20 40 60
thêi gian (phót
)
logN/No

3.3.3.3. Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ ATPase của S. mutans GS-5
Kết quả (hình 3.28) cho thấy axit asiatic ức chế hoạt độ ATPase của S.
mutans GS-5. Ở nồng độ 1,5 mM axit asiatic ức chế 50% hoạt độ ATPase.
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5
nång ®é ( mM)


3.3.3.5. Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ một số enzyme ở S. mutans GS-5.
Chúng tôi cũng đã tìm hiểu tác dụng của axit asiatic lên họat độ của
pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, NADH oxidase của S. mutans GS-5 và
phát hiện thấy rằng axit asiatic ức chế hoạt độ của các enzyme này. Nồng độ axit
asiatic ức chế 50% hoạt độ pyruate kinase, lactate dehydrogenase và NADH
oxidase tương ứng là 1,5 mM, 0,75 mM và 1 mM. Tác dụng ức chế PTS,
pyruvate kinase, lactate dehydrogenase bởi axit asiatic có thể là nguyên nhân làm
cho sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans GS-5 bị ức chế bởi hợp chất này cũng
như bởi dịch chiết Sắn thuyền. Tác dụng ức chế NADH oxidase của axit asiatic
góp phần làm rõ nguyên nhân ức chế tiêu thụ oxy bởi dịch chiết từ lá Sắn thuyền.
3.4. Phân lập một số chủng vi khuẩn S. mutanns từ người Việt Nam
Sử dụng môi trường Mitis Salivaius kết hợp với môi trường TSA pH axit,
dựa trên hình thái khuẩn lạc và hoạt tính catalase chúng tôi đã phân lập 6 chủng
vi khuẩn thuộc chi Streptococcus, được kí hiệu lần lượt là S. sp H1, S. sp H2, S.
sp H3, S. sp H4, S. sp H5 và S. sp H6. Sử dụng kit API20 Strep dựa trên các
phản ứng hoá sinh, chúng tôi sơ bộ kết luận chủng S. sp H1 thuộc loài S. mutans.
Hai chủng S. sp H4 và S. sp H5 thuộc loài S. sanguis và S. sp H6 thuộc loài S.
constellatus. Riêng đối với 2 chủng S. sp H2 và S. sp H3, chỉ số ID thu được
tương đối thấp, vì vậy cần được nhận dạng thêm bằng các phương pháp khác
chính xác hơn.
Hình 3.29. Tác dụng của axit asiatic lên
hoạt độ photphotranspherase của S.
mutans GS-5. Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ
giá trị SD với n = 3
21
3.4.3. Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus bằng kỹ thuật RFLP và PCR


1
1


4
4

5
5

6
6


1
1

2
2

3
3

6
6

Hình 3.39. Sản phẩm PCR 16S ARNr
sau khi cắt bằng HaeIII
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Giếng 2: S. mutans GS-5
Giếng 3: S. sangius NCTC-10904
Giếng 4: S. sp H1
Giếng 5: S. sp H2
Giếng 6: S. sp H3 Hình 3.38. Sản phẩm PCR 16S ARNr
sau khi cắt bằng HpaII
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Giếng 2: S. mutans GS-5
Giếng 3: S. sangius NCTC-10904
Giếng 4: S. sp H1
Giếng 5: S. sp H2
Giếng 6: S. sp H3

5
5
0

0
0
0
0b
b
p
p

1
1
0
0
0
0b
b
p
p

22

2
2

3
3
3.4.4. Một số đặc điểm sinh lý, hoá sinh của 3 chủng vi khuẩn S. mutans H1, S.

thời gian ( phút)

Hình 3.41. Khả năng sinh axit của các
chủng Streptococcus mutans. S. mutans GS-
5 (), S. mutans H1 (), S. mutans H2 (),
S. mutans H3 ()
Hình 3.40.
Điện di trên gel agarose sản
phẩm PCR gen dextranase của các chủng
S. mutans phân lập
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Giếng 2: S. sangius NCTC-10904
Giếng 3: S. mutans GS-5
Giếng 4: S. mutans H1
Giếng 5: S. mutans H2
Giếng 6: S. mutans H3
1
1
,
,
5
5k
k
b
b
Từ các kết quả nghiên cứu thu được chúng tôi rút ra các kết luận sau:
1. Dịch chiết ethanol của Chàm tía, Hương nhu trắng, Kim ngân, Quỷ trâm
thảo, Sài đất, Sao đen và Sắn thuyền có tác dụng ức chế sự sinh axit của vi
khuẩn gây sâu răng S. mutans GS-5, tác dụng này tăng lên khi dịch chiết
được phối hợp với NaF và H
2
O
2
. Các dịch chiết thực vật này đều có tác
Hình 3.42. Khả năng chịu axit của các
chủng Streptococcus mutans phân lập từ
người Việt Nam.
S. mutans GS-5 (),
S.mutans H1 (), S. mutans H2 (), S.
mutans H3 () 24
dụng ức chế sự hình thành biofilm và giết vi khuẩn S. mutans GS-5. Đặc biệt
dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền có tác dụng giết vi khuẩn S. mutans GS-5
ở pH 4 mạnh hơn gấp 6 lần ở pH 7. Dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen cũng
có tác dụng giết một số loài vi khuẩn đường miệng khác như S. sanguis, S.
gordonii và S .rattus.
2. Đã tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc hoá học được hai hợp chất thực
vật thứ cấp thuộc thuộc nhóm oligostilben là hopea phenol (C
56
H
42
O
12

50
tương ứng 1,5 mM, 1 mM và 1 mM) liên quan đến quá
trình tiêu thụ oxy của S. mutans GS-5.
4. Đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn S.mutans H1, S. mutans H2 và S. mutans
H3 từ người Việt Nam nhờ việc nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Mitis
salivarius chọn lọc có pH thấp, kết hợp các phân tích hình thái tế bào với
phân tích đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn gen mã hóa cho ARNr
16S được nhân bản bằng PCR. Chủng vi khuẩn S. mutans H2 có trình tự
đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S ở mức độ tương đồng 100% so với trình tự
đoạn gen này của S. mutans đã công bố trong Genbank.
5. Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền cũng như của axit asiatic,
hopea phenol và malibatol A lên chủng vi khuẩn S. mutans H2 phân lập từ
người Việt Nam là tương tự như lên chủng chuẩn S. mutans GS-5 về khả
năng ức chế sinh axit, giết vi khuẩn cũng như ức chế hoạt độ ATPase, PTS.
ĐỀ NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu cơ chế tác dụng của axit asiatic từ Sắn thuyền
(Syzygium resinosum G) và hopea phenol, malibatol A từ vỏ Sao đen (Hopea
odorata R) lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans để có thể ứng dụng
chúng vào việc bảo vệ răng, miệng.