ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN QUANG HUY

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ CHẤT
THỨ CẤP TỪ THỰC VẬT LÊN VI KHUẨN GÂY
SÂU RĂNG STREPTOCOCCUS MUTANS LUẬN ÁN TIẾN SĨ
SINH HỌC


LUẬN VĂN TIẾN SĨ
SINH HỌC

HÀ NỘI - 2009 MỤC LỤC Trang
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1.
Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan
4
1.1.1.
Bệnh sâu răng
4
1.1.2.

1.3.
Các biện pháp chống sâu răng
22
1.3.1
Sử dụng chất kháng khuẩn
22
1.3.2.
Sử dụng các chất tổng hợp
25
1.3.3.
Sử dụng các hợp chất tự nhiên
26
1.3.4.
Sử dụng các biện pháp khác
28
1.3.4.1.
Liệu pháp thay thế
28
1.3.4.2.
Vaccine phòng chống sâu răng
28
1.3.5.
Tình trạng nhiễm fluo trên răng
28
1.4.
Các chất thứ cấp từ thực vật
29
1.4.1.
Phân loại, cấu tạo hoá học và tính chất của chất thứ cấp từ thực vật
29

Chủng vi sinh vật
40
2.1.2.
Mẫu thực vật
40
2.1.3.
Hoá chất
40
2.1.4.
Thiết bị thí nghiệm
41
2.2.
Phương pháp nghiên cứu
41
2.2.1.
Nuôi cấy vi khuẩn và bảo quản tế bào vi khuẩn
41
2.2.2
Phương pháp nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn gây sâu răng S.
mutans từ các bệnh phẩm mắc bệnh sâu răng
41
2.2.2.1.
Phân lập trên môi trường Mitis salivarius
42
2.2.2.2.
Phân lập trên môi trường TSA pH 5,0
42
2.2.3.
Phương pháp nhận dạng Streptococcus mutans phân lập từ người
Việt Nam

Phương pháp xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn
46
2.2.6.
Phương pháp xác định mức độ gây chết tế bào
46
2.2.7.
Phương pháp xác định khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn
47
2.2.8.
Phương pháp đo mức độ tiêu thụ oxy của tế bào
47
2.2.9.
Xác định hoạt độ một số enzyme quan trọng của S. mutans
47
2.2.9.1.
Chuẩn bị tế bào thấm
48
2.2.9.2.
Phân tích hoạt độ ATPase
48
2.2.9.3.
Phân tích hoạt độ phosphotransferase (PTS)
49
2.2.9.4.
Phân tích hoạt độ NADH oxidase
49
2.2.9.5.
Phân tích hoạt độ lactate dehydrogenase
50
2.2.9.6.

3.1.2.2.
Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 ở pH 7
59
3.1.3.
Khả năng ức chế sự hình thành bioflim của S. mutans GS-5 bởi các
60 dịch chiết thực vật
3.1.4.
Tác dụng của dịch chiết một số thực vật phối hợp với fluo
62
3.1.5.
Tác dụng của dịch chiết một số thực vật phối hợp với H
2
O
2

64
3.1.6.
Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên một số vi khuẩn
đường miệng
65
3.2.
Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp
có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ vỏ cây Sao đen
67
3.2.1.
Tìm hiểu nhóm chất thứ cấp có trong vỏ cây Sao đen
67

3.2.3.7.
Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ NADH
oxidase
77
3.3.
Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp
có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ lá cây Sắn thuyền
77
3.3.1.
Tìm hiểu các nhóm chất thứ cấp có trong lá Sắn thuyền
78
3.3.2.
Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ lá cây Sắn thuyền
79
3.3.3.
Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của axit asatic
83
3.3.3.1.
Tác dụng của axit asiatic lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
83 3.3.3.2.
Tác dụng của axit asiatic lên sự diệt S. mutans GS-5
83
3.3.3.3.
Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ ATPase của S. mutans GS-5
84
3.3.3.4.
ảnh hưởng của axit asiatic lên hoạt độ phosphotransferase của S.

91
3.4.3.
Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus bằng kỹ thuật đa hình độ dài
các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) và PCR
93
3.4.3.1.
Tách ADN tổng số
93
3.4.3.2.
Nhận dạng vi khuẩn bằng kỹ thuật RFLP đoạn gen mã hoá cho
ARNr 16S
93
3.4.3.3.
Nhận dạng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của
gen dextranse của Streptococcus mutans
95
3.4.4.
Một số đặc điểm sinh lý của 3 chủng vi khuẩn Streptococcus
mutans H1, H2 và H3
96
3.4.4.1.
Khả năng sinh axit của S. mutans H1, S. mutans H2 và S. mutans
H3
96
3.4.4.2.
Khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn phân lập từ người Việt
Nam
97
1
MỞ ĐẦU

Sâu răng là một trong số các bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và đang có xu hướng tăng lên đặc biệt ở các nước
đang phát triển. Sự gia tăng của căn bệnh này là do những thay đổi trong lối sống, thói quen sinh hoạt, chế độ ăn uống hàng
ngày và tuổi thọ trung bình. Theo số liệu điều tra gần đây của Viện Răng Hàm Mặt Trung ương, khoảng 90% dân số Việt
Nam mắc các bệnh về răng, miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng và viêm quanh răng. Bệnh sâu răng không chỉ gây ảnh
hưởng tới tình trạng sức khoẻ của người bệnh mà còn gây ra nhiều chi phí tốn kém trong chữa trị.Tổ chức Sức khỏe thế giới
(WHO) đã xếp sâu răng là một trong số các căn bệnh nguy hiểm của loài người. Nhiều chương trình nghiên cứu cũng như
khuyến cáo nhằm mục đích ngăn ngừa và phòng chống bệnh này đã được WHO thực hiện trong những năm qua. Mặc dù tỷ lệ
sâu răng trong cộng đồng dân cư đã giảm đi đáng kể nhưng vẫn còn duy trì ở mức cao và đòi hỏi phải có những biện pháp dự
phòng tốt hơn nữa để đạt mục tiêu mà WHO đưa ra.
Cách tốt nhất để hạn chế bệnh sâu răng là vệ sinh răng, miệng thường xuyên và đúng cách cùng với việc hạn chế dùng các
thức ăn, đồ uống có nhiều đường. Tuy vậy, phương pháp vệ sinh răng miệng, thói quen ăn uống không phải lúc nào cũng thực
hiện được, vì vậy việc sử dụng các chất có khả năng kháng khuẩn như fluo, axit yếu, muối kim loại là một biện pháp để
phòng chống sâu răng. Trong số các chất kháng khuẩn được sử dụng thì fluo là chất có hiệu quả hơn cả.Tuy nhiên, việc sử
dụng fluo lâu dài hay với nồng độ cao có thể dẫn đến chứng nhiễm fluo (fluorosis) làm men răng ố vàng và trở nên sần sùi
(Hamilton, 1990; Aeba, 2002). Chính vì những lý do đó mà xu hướng hiện nay là tìm kiếm các hợp chất mới, có thể thay thế
một phần fluo mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao. Hiện nay, việc tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có tác dụng bảo vệ
răng miệng đang là xu hướng được quan tâm nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn. 2
Việt Nam có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó rất nhiều loài có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học
cao. Từ ngàn xưa, cộng đồng các dân tộc trên đất nước ta đã có truyền thống sử dụng cây cỏ để chữa bệnh, bảo vệ sức khỏe
chống lại bệnh tật trong đó có bệnh sâu răng (Đỗ Huy Bích và tập thể, 2004; Đỗ Tất Lợi, 2001; Lã Đình Mỡi và tập thể,
2001). Tuy nhiên, đến nay việc tìm kiếm các hợp chất mới chưa mang lại nhiều kết quả như mong muốn. Hơn nữa, các nghiên

của hợp chất hopea phenol, malibatol A từ vỏ Sao đen và axit asiatic từ lá Sắn thuyền thông qua việc đánh giá tác dụng
của chúng lên sự sinh axit, khả năng giết vi khuẩn và tác dụng của chúng lên hoạt độ một số enzyme đích trong việc
sinh và chịu axit của vi khuẩn S. mutans GS-5.
 Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu phân lập và nhận dạng đến loài một số chủng vi khuẩn S. mutans từ người Việt
Nam.
Bố cục của luận án:
Luận án gồm 136 trang, 10 bảng số liệu, 47 hình, 209 tài liệu tham khảo tiếng Việt và tiếng Anh. Bố cục luận án gồm: mở
đầu (3 trang), tổng quan tài liệu (36 trang), nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), kết quả nghiên cứu và bàn luận
(59 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), tài liệu tham khảo (21 trang) và phần phụ lục. 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan
Sâu răng là bệnh gây ra bởi vi khuẩn trên mảng bám răng, điển hình là Streptococcus mutans. Những vi khuẩn này sử
dụng các carbohydrate, chủ yếu là đường glucose để lên men tạo ra axit lactic. S. mutans có thể tồn tại và sinh trưởng trong
môi trường pH thấp, có thể duy trì hoạt động trao đổi chất mạnh và tạo ra axit. Axit hình thành sẽ gây ra sự hòa tan các
khoáng chất có trong men răng vốn được cấu tạo bởi hydroxylapatide liên kết với ion canxi tích điện dương và ion phosphate
tích điện âm, dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng (Gibbons và Van, 1975; Nguyễn
Dương Hồng, 1997).
Mặt khác, trên răng các vi khuẩn trong khoang miệng và sản phẩm của chúng cùng với những mảnh vụn thức ăn tạo thành
mảng bám răng. Mảng bám răng không chỉ là nguyên nhân gây ra sâu răng mà còn là một yếu tố chủ yếu gây bệnh nha chu
(Kolenbrander, 2000).
Bệnh sâu răng là một trong 3 bệnh được tổ chức Sức khỏe thế giới (WHO) khuyến cáo về mức độ nguy hiểm chỉ đứng
sau bệnh tim mạch và ung thư. Trong các thập niên trước, tỷ lệ người mắc bệnh sâu răng khá cao đặc biệt ở trẻ em. Trung bình
mỗi trẻ em dưới 12 tuổi có từ 8 đến 10 răng sâu hoặc răng đã bị mất do sâu. Tới năm 1997, số người mắc bệnh sâu răng ở lứa
tuổi trung niên từ 35 đến 44 tuổi tại các nước công nghiệp phát triển vẫn còn ở mức rất cao, chỉ số DMFT (phản ánh số răng
sâu, số răng mất hay trám răng do sâu) ở Canada, Nhật Bản, Úc và các nước Bắc Âu là 13,9, ở Mỹ là hơn 9 (Trịnh Đình Hải,
2004). Hiện nay số bệnh nhân mắc bệnh sâu răng còn cao là do mức sống ngày càng cải thiện, nhiều loại bánh kẹo và sản

giảm khả năng thấm proton (Quivey và tập thể, 2000) Nhờ vậy, S. mutans vẫn có thể tồn tại và sinh axit khi pH môi trường
giảm xuống dưới 4.
Hơn nữa S. mutans cũng có các đặc điểm để chống chịu các stress về oxy hóa, để tồn tại và phát triển. Các vi khuẩn
đường miệng sinh axit lactic thiếu các cytochrome, các protein chứa nhân hem và enzyme catalase nhưng vẫn có thể sinh
trưởng trong môi trường có chứa các gốc oxy tự do vì chúng có hệ thống các enzyme bảo vệ như NADH oxidase, Superoxide
dismutase (Higuchi 1992, 1999).
Việc phân lập, phát hiện sự có mặt S. mutans đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh sâu răng.
Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được nghiên cứu, áp dụng trong phân lập và nhận dạng các chủng S. mutans ở người. Gần đây kỹ
thuật đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) kết hợp kỹ thuật PCR đã được áp dụng cho phép nhận dạng chính xác
và nhanh chóng loài S. mutans (Sato và tập thể, 2003).
1.3. Các biện pháp chống sâu răng
Việc loại bỏ mảng bám răng bằng cơ học (như đánh răng) có tác dụng ngăn chặn sự hình thành mảng bám răng và là
biện pháp phòng chống sâu răng đơn giản nhất. Tuy vậy việc thay đổi thói quen ăn uống và duy trì vệ sinh răng miệng thường
xuyên rất khó thực hiện. Do vậy, hàng loạt các biện pháp khác nhau nhằm ngăn chặn sâu răng đã được nghiên cứu và ứng
dụng. Các biện pháp này chủ yếu dựa trên việc làm giảm số lượng S. mutans trên mảng bám răng, giảm khả năng sinh axit của
S. mutans, hạn chế việc hình thành mảng bám răng, trám bít các hố rãnh Các biện pháp được sử dụng trong việc chống sâu
răng gồm: sử dụng chất kháng khuẩn tổng hợp; sử dụng vaccine phòng chống sâu răng; sử dụng các hợp chất tự nhiên, các 7
chất thay thế đường Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm, không có phương pháp nào là hoàn thiện và vì vậy cần có
sự kết hợp của các phương pháp.
Trong số các phương pháp nêu trên thì việc sử dụng các hợp chất tự nhiên đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới
quan tâm. Nhiều loài thực vật và hợp chất tự nhiên có đặc điểm kháng khuẩn sâu răng đã và đang được phát hiện và nghiên
cứu (Chen và tập thể 1989, Matsumoto và tập thể 1999, Xiao và tập thể 2007 ).
1.4. Các chất thứ cấp từ thực vật
Các hợp chất thứ cấp từ thực vật là các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được sinh ra bởi thực vật. Chúng là các chất
hoá học được tổng hợp và chuyển hoá từ các chất trao đổi bậc nhất như axit amin, protein, axit nucleic, carbohydrate, lipid
hoặc từ các sản phẩm trung gian của quá trình đường phân, chu trình Kreb (Lã Đình Mỡi và tập thể, 2001).
Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học và các thuộc tính lý học của chúng mà các chất thực vật thứ sinh được phân loại thành 3

chứa tryptic soy agar. 9
2.2.2. Phân lập vi khuẩn gây sâu răng S. mutans từ các bệnh nhân sâu răng người Việt Nam trên môi trường Mitis salivarius
kết hợp nuôi cấy ở pH axit.
2.2.3. Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus mutans phân lập từ mẫu bệnh nhân sâu răng người Việt Nam bằng phân tích hình
thái kết hợp các phương pháp PCR-RFLP.
2.2.4. Nuôi cấy biofilm trên môi trường chứa tryptone, cao nấm men và sucrose.
2.2.5. Xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn bằng cách đo độ giảm pH môi trường trong điều kiện dư thừa glucose.
2.2.6. Xác định độ gây chết vi khuẩn bởi các chất tác dụng thông qua việc đánh giá số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của
vi khuẩn còn lại (N) sau các khoảng thời gian khác nhau so với số CFU ban dầu (No). Khi đó giá trị D là khoảng thời gian để
có giá trị Log N/No = -1 (tương ứng với mức 90% số vi khuẩn bị giết chết so với ban đầu).
2.2.7. Xác định khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn thông qua việc đếm số CFU sau các khoảng thời gian khác nhau ở
pH thấp.
2.2.8. Xác định mức độ tiêu thụ oxy của tế bào trong điều kiện dư thừa glucose bằng điện cực oxy.
2.2.9. Xác định hoạt độ một số enzyme chính liên quan đến đặc trưng sinh axit và chịu axit thông qua sự chuyển hóa của các
chất đặc hiệu.
2.2.10. Xác định thành phần một số hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết thực vật bằng các phản ứng đặc trưng.
2.2.11. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất bằng phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) với sự giúp đỡ của Viện
hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học Việt Nam.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 10
3.1. Nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có khả năng kháng khuẩn sâu răng
3.1.1. Khả năng ức chế của dịch chiết một số thực vật lên sự sinh axit của S. mutans
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng 7 loài thực vật là: Chàm tía Strobilanthes cusia B. (CTI), Hương nhu trắng
Ocimum gratissimum L. (HNT), Kim ngân Lonicera japonica T. (KNG), Quỷ trâm thảo Bidens pilosa L. (QCT), Sài đất

2
Chàm tía
5,24  0,16
4,36  0.20
3
Hương nhu trắng
4,92  0,26
4,25  0,08
4
Kim ngân
5,37  0,20
4,98  0,13
5
Quỷ châm thảo
5,20  0,07
4,36  0,08
6
Sài đất
4,76  0,39
4,56  0,14
7
Sao đen
6,83  0.06
5,12  0,09
8
Sắn thuyền
6,51  0,19
5,02  0,05
Các giá trị sau  là giá trị SD với n =5
3.1.2. Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 bởi các dịch chiết thực vật

logN/No
DC CTI HNT KNG
QCT SDA STH SDE
13
Hình 3.6. Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 của các dịch chiết tại pH 7. Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n = 3.
3.1.3. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm S. mutans GS-5 của các dịch chiết thực vật
Sự hình thành biofilm ở mẫu thí nghiệm kém hơn rõ rệt so với đối chứng. Ở mẫu đối chứng vi khuẩn S. mutans mọc dày
đặc tạo thành lớp màng bám trên tấm kính, còn mẫu thí nghiệm vi khuẩn mọc thưa và ít hơn. So sánh sinh khối tế bào trên
biofilm nhận thấy sinh khối biofilm của mẫu thí nghiệm tăng lên ít hơn so với mẫu đối chứng (bảng 3.3). Đặc biệt với mẫu xử
lý bằng dịch chiết Sao đen hay Sắn thuyền, lượng sinh khối tế bào tăng lên tương ứng 12,1% và 20,5% của mẫu đối chứng
(tức là sự hình thành biofilm đã bị ức chế tương ứng 87,9% và 79,5%). Đây là phát hiện có ý nghĩa thực tiễn, do có nhiều chất
có tính kháng khuẩn ở dạng huyền dịch nhưng không có tác dụng với các tế bào ở dạng biofilm vì bị hạn chế về khả năng
khuyếch tán và rất khó kiểm soát khi sử dụng các chất kháng khuẩn thông thường như hiện nay.
Bảng 3.3. Tác dụng của dịch chiết thực vật lên sự hình thành biofilm ở S. mutans GS-5
Mẫu
Đối
chứng
CTI
HNT
KNG
QCT
SDA
SDE
STH
% sinh
khối tăng
100

3.1.5. Tác dụng của dịch chiết thực vật phối hợp với H
2
O
2
lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy khi phối hợp dịch chiết với H
2
O
2
(0,3 mM) tác dụng ức chế sự sinh axit của S.
mutans GS-5 cao hơn so với khi sử dụng dịch chiết hay H
2
O
2
ở

dạng riêng lẻ. Tác dụng này là tương tự như khi phối hợp dịch
chiết với NaF.
Bảng 3.4 và 3.5. Tác dụng của dịch chiết thực vật phối hợp với NaF hay H
2
O
2
lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
Mẫu
nghiên
cứu
Giá trị pH cuối cùng
Giá trị pH cuối cùng
Không bổ
sung NaF

15
HNT
5,28  0,09
6,21  0,08
5,32  0,13
6,23  0,17
KNG
5,05  0,13
6,14  0,10
5,45  0,05
6,84  0,14
QCT
5,15  0,12
6,04  0,15
5,15  0,05
6,21  0,13
SDA
5,10  0,08
5,97  0,21
5,45  0,04
6,01  0,21
SDE
6,78  0,06
7,11  0,09
6,82  0,12
7,14  0,12
STH
6,10  0,08
6,97  0,21
6,45  0,04

thêi gian ( phót)
LogN/No

-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 15 30 45 60
thêi gian ( phót)
LogN/No

Hình 3.11. Tác dụng diệt vi khuẩn của dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen với S. gordonii ATCC-10558 (A), S. sanguis
NCTC-10904 (B), S. rattus FA-1 (C). Đối chứng (), SDE (), STH ().
Ngoài ra, chúng tôi cũng còn phát hiện thấy dịch chiết SDE và STH có tác dụng ức chế mạnh với sự tiêu thụ oxy của S.
mutans GS-5 (dẫn liệu không trình bày ở đây).
Với các kết quả điều tra bước đầu về hoạt tính chống sâu răng của 7 loại dịch chiết thực vật, chúng tôi đã lựa chọn dịch
chiết của Sao đen và Sắn thuyền cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ cây Sao đen
3.2.2. Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ vỏ cây Sao đen
Để tách, tinh sạch một chất thực vật thứ cấp từ vỏ Sao đen chúng tôi đã chiết các chất ra khỏi mẫu bằng cách ngâm mẫu
trong ethanol (tỷ lệ 1 g mẫu: 10 ml ethanol) trong thời gian 5 ngày. Dịch chiết sau đó được cô lại và được chiết tiếp bằng n-
hexan, chloroform, ethyl acetate và n-butanol (với độ phân cực tăng dần). Chloroform thể hiện có hiệu suất chiết cao nhất. Khi
A
B
C
4a
5a
6a
7a
8a
9a
10a
11a
12a
13a
14a
1b
2b
3b
4b
5b
6b
7b
8b
9b
10b
11b
12b
13b
14b
1b'
2b'
3b'
4b'
5b'

HO
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9'
10'
11'
12'
13'
14'