VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP
BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG BÈO TẤM MANG GEN KHÁNG
NGUYÊN H5N1 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM Ở GIA CẦM

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Di truyền Nông nghiệp
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Huy Hàm
Thời gian thực hiện: 01/2007-06/2011

8908 Hà Nội, 2011
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

H/2 Môi trường Hutner/2
LG Lemna gibba
LM Lemna minor
MS Murashige and Skoog
MSC Multi - Cloning Site
MCPA 2-methyl – 4 cholorophenoxy acetic acid
MCH Mean corpuscular hemoglobin - giá trị hemoglobin trung bình
MCHC Mean corpuscular hemoglobin concentration - nồng độhemoglobin trung bình
MCV Mean corpuscular volume - thể tích hồng cầu trung bình
MPV Mean platelet volume - thể tích trung bình của tiểu cầu
NAA 2- naphthalen-1-yl acetic acid
NOS Nopalin Sythetase
OD Optical Density (mật độ quang học)
PCR Polymerase Chain Reaction
RBC Red blood cell - số lượng hồng cầu (đơn vị 10
12
tế bào/L)
RDW Red cell distribution width - độ phân bố về kích thước của hồng cầu
SP Spirodela polyrrhiza
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
TAE Tris-Acetate-EDTA
TE Tris-EDTA
T- DNA Transfer DNA
TDZ Thidiazuron
Ti-Plasmid Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật)
VIR Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u)
WBC White blood cell - số lượng bạch cầu
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
MỤC LỤC

Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56
NỘI DUNG A: TẠO DÒNG MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN 56
Nội dung 1: Thu thập, đánh giá nguồn vật liệu ban đầu (vật liệu TV) cho các
nghiên cứu biến nạp di truyền 56
Nội dung 2: Xác định trình tự gen quan tâm, so sánh với các trình tự gen đã
công bố trước đó, xác định những thay đổi về mặt cấu trúc gen 57
Nội dung 3: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên HA, NA của virus
H5N1 trên cúm gia cầm tại Việt Nam 61
Nội dung 4: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên dạng đột biến mất đoạn
hoặc gen dung hợp các đoạn peptid khác nhau hoặc các epitope khác
nhau 63
4.1. Tách dòng gen HA gắn enzyme giới hạn nhận biết 63
4.2. Tách dòng gen HA1 gắn enzyme giới hạn nhận biết 64
4.3. Cải biến gen HA1 65
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
4.3.1. Cải biến vị trí MD2 trên đoạn gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer 65
4.3.2. Cải biến vị trí MD5, MD3 trên gen HA1 bằng phương pháp Quickchange 67
4.3.3. Cải biến vị trí MD4 trên gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer 68
4.3.4. Cải biến vị trí M2 trên đoạn gen HA1 sử dụng phương pháp OE-PCR kéo
dài các đoạn gối lên nhau 70
NỘI DUNG B. TẠO VI SINH VẬT BIỂU HIỆN GEN H5N1 TRÊN BỀ MẶT
73
Nội dung 5: Tạo dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp của virus H5N1
trong E.coli phục vụ mục đích phát triển kháng thể chuyên biệt với
các kháng nguyên của H5N1. 73
NỘI DUNG C. TẠO BÈO TẤM MANG GEN PROTEIN VỎ VIRUS H5N1
77
Nội dung 6: Lựa chọn, sưu tập, định danh, đánh giá khả năng sinh trưởng
phát triển của một số giống bèo tấm đáp ứng yêu cầu là cây chủ để sản
xuất protein tái tổ hợp. 77

11.5. Ảnh hưởng của kích thước hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus
và khả năng tái sinh 121
Nội dung 12: Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và
nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza bằng A. tumefaciens 122
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
12.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 122
12.2. Kết quả nghiên cứu lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào bèo
tấm SP thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 123
12.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus
ở SP nguyên cây và callus 123
12.4. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời
của gen gus ở SP nguyên cây và callus 124
12.5. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời
của gen gus ở SP nguyên cây và callus 126
Nội dung 13. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm 129
13.1. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm thông qua A. tumefaciens
129
13.2. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm bằng súng bắn gen 130
Nội dung 14. Phân tích đánh giá cây chuyển gen bằng các phương pháp SHPT
131
14.1. Tách chiết và kiểm tra DNA tổng số của ba loài bèo tấm L. minor, L. gibba,
S. polyrrhiza 131
14.2. Phân tích PCR sự có mặt của gen chuyển trong ba loài bèo tấm L. gibba,
L. minor, S. polyrrhiza chuyển gen 131
14.3. Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp Southern blot 135
14.4. Phân tích Western blot 137
14.4.1. Kết quả điện di protein tổng số 138
14.4.2. Kết quả kiểm tra phản ứng lai miễn dịch với kháng thể H5 bằng kỹ thuật
Western blot 138

PHỤ LỤC 6. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 182
DANH MỤC BẢNG
B
ả
ng 2.1.
Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm 14
B
ả
ng 2.2.
Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo 15
B
ả
ng 2.3.
Codon ưu tiên sử dụng trong bèo tấm, thực vật (một, hai lá mầm) và
virus H5N1 (Dickey et al., 2007, Murray et al., 1989, Zhou et al., 2005)
26
B
ả
ng 3.1.
Trình tự các primer sử dụng để gắn các enzyme cắt đặc hiệu (RE) vào
đầu gen HA, HA1
33
B
ả
ng 3.2.
Trình tự các primer tạo đột biến điểm trên gen HA 33
B
ả
ng 3.3.
Trình tự các primer sử dụng nhân cấu trúc CAMV35Sprom-GUS-

B
ả
ng 4.1
. Số trình tự H5 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) 56
B
ả
ng 4.2.
Số trình tự N1 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) 57
B
ả
ng
4.3.
Các vị trí đã được cải biến trên gen HA1 73
B
ả
ng 4.4.
Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng môi trường đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của các loài bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza
80
B
ả
ng 4.5.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza
82
B
ả
ng 4.6.
Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên khả năng sinh trưởng của các
loài bèo tấm

Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen gus
tạm thời ở cánh bèo tấm chuyển gen
121
B
ả
ng 4.13
. Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện tạm
thời của gen gus ở callus bèo S. polyrrhiza chuyển gen
122
B
ả
ng 4.14.
Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm
thời ở bèo nguyên cây chuyển gen
123
B
ả
ng 4.15.
Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm
thời ở callus bèo S. polyrrhiza chuyển gen
124
B
ả
ng 4.16.
Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở
bèo nguyên cây
125
B
ả
ng 4.17.

130
B
ả
ng 4.23.
Tổng hợp số thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo
tấm chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
133
B
ả
ng 4.24.
Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên HA1 vào bèo
tấm bằng súng bắn gen
135
B
ả
ng 4.25.
Danh sách các mẫu máu gà thu được 145
B
ả
ng 4.26.
Kết quả số lượng bạch cầu 146
B
ả
ng 4.27.
Bảng kết quả tổng hợp một số chỉ tiêu của máu 147
B
ả
ng 4.2
8
.

Hình 4.6. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD2 trên gel 0,8% agarose.
66
Hình 4.7. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD5 trên gel agarosre 2%
68
Hình 4.8. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD3 trên gel agarosre 2%
68
Hình 4.9. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD4 trên gel 0,8%
69
Hình 4.10. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí M2 trên gel agarose 0,8%
70
Hình 4.11. So sánh trình tự nucleotide và amino acid giữa gen HA1 và HA1
M
tại vùng cải biến
71
Hình 4.12. Sơ đồ gắn gen HA vào plasmid pET-22b(+)
74
Hình 4.13. Kết quả kiểm tra vector pET22b
(+)
cắt bằng HindIII và NotI (giếng
1) và pCR2.1-H5 cắt bằng EcoRI (giếng 2).
75
Hình 4.14. Minh hoạ thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
76
Hình 4.15. Nuôi gà thí nghiệm và gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1, và
lấy máu kiểm tra tối miễn dịch.
77
Hình 4.16. Lấy máu gà trước khi gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1 (trên
trái), sau đó tiêm vaccine H5N1 dưới da cổ để gây tối miễn dịch cho gà (trên
phải) và lấy máu gà 14 ngày tuổi trước khi tiêm vaccine
77

98
Hình 4.28. Sơ đồ vector pPAMSpHA1
99
Hình 4.29. Sơ đồ thiết kế vector pPAM mang gen HA1
101
Hình 4.30. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-HA1 trên gel agarose
0,8%.
103
Hình 4.31. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-HA, pPAM- HA1
M
trên
gel agarose 0,8%
103
Hình 4.32. Sơ đồ thiết kế vector pCAMBI-HA1 và pCAMBIA-Sp-HA1
104
Hình 4.33. Sơ đồ cấu trúc SHA1N trong plasmid pJET-SHA1N
106
Hình 4.34. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế và kiểm tra pJET-SHA1N, pJET-
SHA1
M
N trên gel agarose 0,8%.
107
Hình 4.35. Hình ảnh điện di các sản phẩm trong quá trình thiết kế và kiểm tra
108
Hình 4.36. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pCAMBIA-Sp-HA1, pCAMBIA-
Sp-HA1
M
trên gel agarose 0,8%.
110
Hình 4.37. Sơ đồ vector pCAMBIA-Sp-HA1

136
Hình 4.50. Kết quả lai DNA của các dòng bèo tấm chuyển gen
137
Hình 4.51. Kết quả điện di protein tổng số các dòng bèo chuyển gen
138
Hình 4.52. Kết quả phân tích Western blot các dòng bèo chuyển gen
139
Hình 4.53. A. Gà nuôi trong chuồng; B. Cho gà ăn bèo chuyển gen
140
Hình 4.54. Lấy máu gà
141
Hình 4.55. (A) Tế bào hồng cầu và bạch cầu Eosinophil; (B) Tế bào hồng cầu
và bạch cầu neutrophil; (C) Tế bào hồng cầu và bạch cầu lympho
144
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
1
Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 thế giới chứng kiến những thành tựu vượt
bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo
ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính khác biệt như chống chịu sâu, bệnh,
kháng thuốc diệt cỏ Đến năm 2010 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đạt 148 triệu
ha. Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn, mặn,
tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường
chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học đã được
nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (www.isaaa.org).
Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng
cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất
chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên,

thể coi dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến nay là cúm A hiện đại mới xuất hiện.
Virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan
sang hàng chục quốc gia của nhiều châu lục trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Cơ
bản về cấu trúc virus cúm vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực,loài vật chủ nhiễm
bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn
và khác với những biến chủng H5N1 trước đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc
phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005,
bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, trong đó có Nga, rồi tràn ngập vào các
nước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc-Trung Phi, đặc biệt Ai Cập
và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất (Hulse-Pot et al., 2005, Subbarao,
Luke, 2007, Zhao et al., 2008). Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, tái phát
vào năm 2004, 2005. Mặc dù đã áp dụng nhiều biện pháp phòng chống, cho đến nay
vẫn còn những ổ dịch nhỏ (www.cucthuy.gov.vn).
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền
Nông nghiệp đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép thực hiện đề
tài “Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống
bệnh cúm ở gia cầm” thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công
nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo giống bèo tấm mang gen biến nạp HA và NA có khả năng gây miễn dịch
bệnh cúm gia cầm thông qua đường tiêu hoá.
1.3. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu trong đề tài này là ba loài bèo tấm L. gibba, L. minor, S.
polyrrhiza; gen kháng nguyên HA1 của virus H5N1.
1.4. Phạm vi nghiên cứu
Các nghiên cứu tái sinh, tạo callus và chuyển gen kháng nguyên HA1 của virus
H5N1ở các loài bèo tấm L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza trong điều kiện phòng thí
nghiệm
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
3

2
). Người ta đã nhận thấy rằng trong một số trường hợp sử dụng vaccine tiêm,
kháng thể tạo thành trong máu nhưng lại không tìm thấy ở hệ màng nhầy. Trong khi
đó màng nhầy lại là cửa ngõ xâm nhập vào cơ thể của nhiều tác nhân gây bệnh. Nếu
gây miễn dịch hệ thống màng nhầy, tác nhân gây bệnh sẽ bị chặn ngay lại khi xâm
nhập vào cơ thể (Mestecky & et al, 2005).
Hướng tiếp theo có tiềm năng giảm giá thành vaccine là sử dụng thực vật
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
4
chuyển gen để sản xuất vaccine. Có nhiều hệ thống sản xuất các protein tái tổ hợp cần
thiết cho các mục đích khác nhau của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động
vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen
được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế
bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men. Ví dụ, hệ thống sản xuất vaccine sử
dụng vi khuẩn có khả năng cho lượng protein cao nhưng vi khuẩn không có khả năng
biến tính protein tạo thành bằng các phản ứng glycosit hoá, do đó hoạt tính của
protein tạo thành bị hạn chế (Knusadi et al, 1997). Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho
các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử
dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là
thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản
xuất protein tái tổ hợp. Trước hết phải kể đến khả năng glycosit hoá protein, đó là
một yếu tố rất quan trọng bởi vì các protein có khả năng gây miễn dịch đối với virus,
vi khuẩn thường là glycoprotein, nhóm glycosyl thường là yếu tố không thể thiếu
được cho phản ứng tạo miễn dịch (Alkhatib et al, 1984). Lợi thế thứ hai là protein tạo
thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein tạo thành từ tế bào động vật bậc
cao bởi thực vật thường không là vật chủ của các nguồn gây bệnh cho người và động
vật (Ganz et al, 1996; Cramer et al, 1999). Cuối cùng là lợi thế về giá thành: Thực vật
có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí tối thiểu về phân bón, công chăm sóc… So
với việc nuôi cấy tế bào, chí phí đó hầu như không đáng kể. Vaccine do thực vật sản
xuất ra thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật"

2001) và Epitope VP1 (bệnh lở mồm long móng) ở khoai tây (Carrillo et al, 2001).
Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng
ứng dụng của vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất
lớn, nó không những sẽ góp phần giảm rất đáng kể giá thành vaccine mà còn mở ra
những triển vọng mới trong việc ứng dụng CNSH thực vật cho mọi mặt của đời sống.
2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1
2.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới
Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược,
nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao, Luke, 2007). Đối với dịch
cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm
được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm
này sang người. Nhiều công trình nghiên cứu về gen H5N1 và phát triển công nghệ
cũng như vaccine gây miễn dịch cho gia cầm được xúc tiến mạnh mẽ. Kháng thể đặc
hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và đó
là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm,
góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Có nhiều
loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể kháng HA (H5) có vai trò tiên quyết
quan trọng trong quá trình trung hòa virus phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai
loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới (Capua & Alexander, 2008,
Subbarao & Luke, 2007). Virus cúm H5N1 rất độc có thể giết chết ngay phôi gà
(nguyên liệu dùng trong sản xuất vaccine) từ khi mới cấy virus vào phôi. Vì vậy loại
bỏ vùng gây độc là tiêu chí bắt buộc khi sản xuất vaccine.
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
6
 Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng.
Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologus vaccine), đó là các loại vaccine được sản
xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa
(Swayne, Suarez, 2000). Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologus vaccine) là vaccine
sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng
có kháng nguyên NA dị chủng.

2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
7
- Lựa chọn gen cần được biểu hiện và đưa vào vector thích hợp;
- Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen;
- Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng
các phương pháp chuyển gen khác nhau;
- Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực
vật;
- Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật;
- Sử dụng vaccine đã được thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi hoặc dưới
dạng thức ăn đã chế biến.
Các thành tựu về công nghệ chuyển gen ở thực vật trong hướng nghiên cứu
vaccine đường miệng: nghiên cứu vaccine virus viêm gan B biểu hiện trong chuối
(Kumar et al., 2005), rau diếp (Marcondes & Hansen, 2008), vaccine chống bệnh
đường ruột (Carol et al., 2007), vaccine chống bệnh SARS-CoA ở nhiều loài thực vật
(Li et al, 2006), vaccine từ gạo chống bệnh dị ứng phấn hoa (Takagi et al., 2005).
Tuy nhiên, nghiên cứu về sử dụng H5N1 làm vaccine ăn được còn rất hạn chế
(Khandelwaal et al., 2003)
2.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 ở Việt Nam
Từ năm 2006 nhờ áp dụng chương trình tiêm chủng mở rộng trên toàn quốc đã
hạn chế đáng kể sự lây lan dịch bệnh cúm gà. Nhu cầu sản xuất vaccine trở nên cấp
bách hơn bao giờ hết.
Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A
với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân týp HA
và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ
chức thế giới. Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ Sinh học kết hợp với
Viện Thú y, Xí nghiệp Thuốc thú y Trung ương, Công ty Thuốc thú y Trung ương II,
Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương, thực hiện nghiên cứu có được
vaccine sản xuất từ chủng NIBRG-14 (Lê Trần Bình, 2007). Đây là chủng vaccine
được tạo ra bằng công nghệ di truyền ngược tại Viện Tiêu chuẩn và kiểm định sinh

dòng Quảng Đông và clade 1 (Trần Quang Vui et al., 2008).
Hemagglutinin (HA) có thể được coi là một loại protein vừa quyết định tính
kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm A. Protein HA là một
glycoprotein thuộc protein màng týp I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu
gà trong ống nghiệm (in vitro). Kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự
ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI-Hemagglutinin
Inhibitory antibody). Có 16 phân týp HA đã được phát hiện (H1-H16), ba phân týp
(H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm
trong lịch sử (Murphy & Webser, 1996). Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt
capsid của một virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ
(Bender et al., 1999, Wagner et al., 2002).
Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130Å, thường ở dạng kết 3 (trimer),
mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ chuỗi HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa).
Các đơn phân liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau
khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
9
chuỗi HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi hạt HA1 chứa đựng vị trí gắn
với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch et al., 1981,
Wagner et al., 2002). Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa
sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật
chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá
trình nhân lên ở tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu
hình không gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này
trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài
vật chủ khác nhau (Wagner et al., 2002, Webser, 1998). Vị trí amino acid 226
(aa226) của chuỗi HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể
đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là
Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2.3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với
nhóm hydroxyt (4-OH) của galactose ở góc quay α-2.3) của tế bào biểu mô đường hô

H5 cường độc, loại H5N1, motif chuỗi nối này có cấu trúc là TPQRERRKKR, loại
H5N2: motif chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRKRKTR, trong khi đó, đối với subtýp
H5 vô độc (hoặc nhược độc thấp), tất cả các loại H5N1, H5N2, H5N3, H4N6, và
H1N1, motif chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRETR (Horimoto, Kawaoka, 1995,
Zhou et al., 1999). Đối với chủng cường độc H7, motif này là P−K−G−R (Horimoto,
Kawaoka, 2006). Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh, mặc dù trên bề mặt virus có
hai kháng nguyên glycoprotein là HA và NA nhưng chỉ có HA có khả năng gây đáp
ứng miễn dịch bảo hộ (Chen et al., 2004, Justerwicz et al., 1995). Để chứng minh có
điều đó, gần đây nhất, các nhà khoa học đã thành công trong việc tạo vaccine tái tổ
hợp bằng cách đưa các đoạn gen mã hóa kháng nguyên HA hoặc tiểu đơn vị của
kháng nguyên HA (HA1, HA2) của chủng H5N1 vào biểu hiện trong adenovirus.
Điều đáng chú ý là kháng nguyên HA1 và HA tái tổ hợp có mức bảo hộ 100% đối với
gà thực nghiệm, trong đó kháng nguyên HA2 có mức độ bảo hộ 60%.
Hemagglutinin với nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật
Vấn đề biểu hiện và sản xuất kháng nguyên HA ở lượng đáng kể được quan
tâm nghiên cứu từ năm 2002 trở lại đây. Nhiều loại protein, enzyme và kháng nguyên
đã biểu hiện thành công trong tế bào vi sinh vật và đã được áp dụng rộng rãi trong
thực tế cuộc sống như dùng làm thuốc, thực phẩm chức năng… Kháng nguyên HA
cũng như các tiểu phần HA1, HA2 của một số virus cúm A như H1N1, H3N2, H7N9
và H5N1 đã được nghiên cứu biểu hiện trong tế bào vi sinh vật như E. coli,
Baculorvirus, nấm men P. pastoris và S. cerevisiiae (Yi Minh Xu et al., 2006). Việc
biểu hiện gen này trong thực vật đang được tiến hành nghiên cứu, tuy nhiên, có
những kết quả trái ngược nhau được công bố. Nghiên cứu của Bruchmüller và cộng
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
11
sự, 2007, cho thấy HA1 đã cải biến mã codon thích hợp với thực vật được biểu hiện
cao trong cây đại mạch dưới sự điều khiển của promoter gliadin lúa mỳ. Phân tích
bằng Western blot khẳng định sự biểu hiện của HA1 trong hạt của 84 dòng chuyển
gen HA1. Những nghiên cứu của D
’

(cánh bèo) có kích thước khác nhau phụ thuộc vào từng chi, từng loài.
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
12
Đặc điểm cánh bèo: Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là
“frond” (cánh bèo), là một tập hợp của các mô có sự biệt hóa hạn chế. Mức độ tổ
chức của mô cánh bèo trong họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella
và Wolffia. Cánh bèo không ở dạng phẳng mà tồn tại các u lồi đặc trưng trên đó có
định vị các gân lá, cây trưởng thành thường có từ 4-7 gân lá trong khi các cây non chỉ
có 3 gân lá. Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá. Một số loài có cánh không dẹt do
có xoang khí lớn. Cánh bèo có hình ô van (hoặc tròn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm
(S. polyrrhiza, L. trisulca). Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối
ưu. Ở điều kiện thường có thể nhỏ hơn 1 mm (Wolffia). Kích thước và hình dạng của
cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên ngoài và kiểu gen của chúng. Các
yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ,
phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ…(Landolt, 1986).
Đặc điểm rễ bèo: Kích thước và số lượng rễ trên 1 cánh bèo ở các loài bèo
tấm không giống nhau và phụ thuộc vào từng loài. Đa số các loài thuộc họ Lemna chỉ
có một rễ, S. polyrrhiza có từ 7-12 rễ hoặc nhiều hơn và có thể dài đến 10 mm,
Landoltia có 2-3 rễ và có thể lên đến 5 rễ với chiều dài tối đa có thể đạt được là 6 mm.
Ngoại trừ điều kiện khắc nghiệt, trong điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay các chất
khoáng, rễ sẽ dài hơn. Trong khi đó, trong môi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn
hơn và thậm chí có loại không hình thành rễ. Cấu trúc rễ của bèo tấm cũng hết sức
đơn giản, không có các rễ con và không phản ánh sự tăng trưởng cũng như sự tạo
nhánh. Vì lẽ đó, rễ của bèo tấm rất mảnh và nhỏ. Cũng giống như các loại rễ phổ biến
khác, rễ bèo tấm có cấu tạo gồm 4 phần chính: Đỉnh rễ (root cap), vùng mô phân sinh
(meristematic region), vùng kéo dài (elongation zone), và vùng các tế bào thuần thục
(zone of mature cells).
Hoa và quả bèo: Hoa của các loài bèo tấm đã được nghiên cứu tương đối kĩ.
Chúng thường hình thành và tồn tại trong thời gian ngắn và hiếm khi được quan sát
thấy. Hoa của các loài bèo có thể hình thành trong thời gian ngắn hay dài khác nhau