BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VỚI VƯƠNG QUỐC BỈ
(Giai đoạn 2007 – 2009) BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI





Nghiên cứu phát triển vaccine thực vật dùng qua đường
miệng cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt Nam
(Development of a plant-based veterinary oral vaccine to
combat avian influenza in Vietnam) Chủ nhiệm đề tài: TS. Lê Văn Sơn
Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học
Địa chỉ: Nhà A10, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội
Điện thoại: 37562368 E-mail: Hà Nội, 12/2009
 Báo cáo tổng kết đề tài – Lời cảm ơn
Thời gian thực hiện 2007-2009
i
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm
ơn:
 Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cấp kinh phí thực hiện.
 Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Kế hoạch tài chính -
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều
kiện tốt để đề tài thực hiện đúng tiến độ̣.
 Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
gen - Viện Công nghệ
sinh học đã thực hiện việc giải trình tự gen.
 Trại sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế - Viện Công nghệ sinh học
đã hỗ trợ ra cây ngoài nhà lưới.
 Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học đã thực hiện
việc kiểm tra mức độ đáp ứng miễn dịch trên động vật. Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên: Lê Văn Sơn
Ngày, tháng, năm sinh: 22/01/1967 Nam/ Nữ: Nam
Học hàm, học vị: Tiến sỹ
Chức danh khoa học: Chức vụ:
Điện thoại: Tổ chức: 043 7562368 Mobile: 0915570750
E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Viện Công nghệ
sinh học
Địa chỉ tổ chức: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầy Giấy, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: xóm 4B, Cổ Nhuế, Từ Liêm, Hà Nội 2
3. Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:
Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam
Điện thoại: 37562790 Fax: 38363144
E-mail:
Website:

Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS. TS. Trương Nam Hải
Số tài khoản: 931.01.064
Ngân hàng: Kho bạc nhà nước Ba Đình, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Khoa học và Công nghệ

II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài/dự án:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 06 năm 2007 đến tháng 05 năm 2009
- Thực tế thực hiện: t

3 2009 98, 400 000 98, 400 000

Cộng 950 950
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SN
KH
Nguồn
khác
Tổng SN
KH
Nguồn
khác
1 Trả công lao động
(khoa học, phổ
thông)
193,7 193,7 0 213,700000 213,700000 0
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
469,8 469,8 0 497,518075 497,518075 0
3 Thiết bị, máy móc 0 0 0 0 0 0
4 Xây dựng, sửa chữa


4 1116/KHCNVN-
HTQT ngày
8/8/2007
Thay đổi chủ nhiệm nhiệm vụ hợp tác KHCN
theo Nghị định thư

5 2312/QĐ-
BKHCN-XHTN
ngày 14/9/2009
Gia hạn thời gian thực hiện nhiệm vụ hợp tác
KHCN theo Nghị định thư

6 2976/QĐ-
BKHCN-XHTN
ngày 26/11/2009
Thay đổi nội dung-kinh phí của nhiệm vụ hợp
tác KHCN theo Nghị định thư

7 3157/QĐ-
BKHCN-XHTN
ngày 19/12/2009
Điều chỉnh kinh phí mua vật tư hóa chất của
nhiệm vụ hợp tác KHCN theo Nghị định thư

8 564a/QĐ-CNSH
25/12/2009
Thành lập hội đồng nghiệm thu quy trình
KHCN


dịch trên gia
cầm

5
2 Trường Đại
học Tự do
(VUB), Vương
quốc Bỉ
Trường Đại học Tự
do (VUB), Vương
quốc Bỉ
- Thiết kế vector
- Chuyển gen
- Phân tích cây
chuyển gen
- Kiểm tra hiệu
quả sản phẩm
Đào tao, hợp tác
nghiên cứu
3 Trung tâm Thú
y và Nông
nghiệp (VAR-
CODA-
CERVA),
Vương quốc
Bỉ
Trung tâm Thú y và
Nông nghiệp (VAR-
CODA-CERVA),
Vương quốc Bỉ

chuyển gen
3 TS Nguyễn
Trung Nam
TS Nguyễn
Tường Vân
Chuyển gen vào
arabidopsis
Cây arabidopsis
chuyển gen
4 CN Phan Trọng
Hoàng
CN Phan Trọng
Hoàng
Chuyển gen vào
thuốc lá
Cây thuốc lá
chuyển gen
5 TS Nguyễn Bá
Thành
KS Bùi Phương
Thảo
Tối ưu quy trình
chuyển gen đậu
tương
Quy trình chuyển
gen
6 Prof. Dr. Geert
Angenon
TS Chu Hoàng
Hà

6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số
TT
Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 2007: 01 cán bộ sang VUB, Bỉ để
thực tập nghiên cứu, kinh phí đi lại
phía VN cấp
2007: 01 cán bộ sang VUB, Bỉ để
thực tập nghiên cứu, kinh phí đi lại
phía VN cấp
2 2008: 03 cán bộ sang VUB, Bỉ để
thực tập và hội thảo, kinh phí đi lại
phía VN cấp
2008: 01 cán bộ sang VUB, Bỉ để
hội thảo, kinh phí đi lại phía VN cấp
3 2008: 04 chuyên gia Bỉ sang VN để
trao đổi đề tài, kinh phí sinh hoạt
phía VN cấp
2008: 04 chuyên gia Bỉ sang VN để
trao đổi đề tài, kinh phí sinh hoạt
phía VN cấp
4 2009: 02 chuyên gia Bỉ sang VN để
trao đổi đề tài, kinh phí sinh hoạt
phía VN cấp
2009: 01 chuyên gia Bỉ sang VN để
trao đổi đề tài, kinh phí sinh hoạt
phía VN cấp

6/2007-
12/2007
Viện CNSH
2 Xây dựng tối ưu quy trình chuyển
gen vào Arabidopsis và cây đậu
tương
6/2007-
3/2008
6/2007-
3/2008
Viện CNSH
3 Tạo các dòng cây chuyển gen 4/2008-
12/2008
4/2008-
4/2009
Viện CNSH
4 Phân tích mức độ phân tử các
dòng cây chuyển gen
10/2008-
12/2008
1/2009-
8/2009
Viện CNSH
5 Đánh giá sơ bộ hiệu lực của
kháng nguyên
1/2009-
5/2009
5/2009-
11/2009
Phòng Miễn

b) Sản phẩm Dạng II:
(Nguyên lý ứng dụng; phương pháp; tiêu chuẩn; quy phạm; phần mềm máy tính; bản vẽ
thiết kế; quy trình công nghệ; sơ đồ, bản đồ; số liệu, cơ sở dữ liệu; báo cáo phân tích; tài
liệu dự báo (phương pháp, quy trình, mô hình, ); đề án, qui hoạch; luận chứng kinh tế-kỹ
thuật, báo cáo nghiên cứu khả thi và các sản phẩm khác)
Yêu cầu khoa học cần đạt Số
TT
Tên sản phẩm

Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1 Quy trình chuyển gen vào cây đậu
tương
1 1
2 Kết quả phân tích khả năng gây
miễn dịch của sản phẩm trên đối
tượng gia cầm
1 1
c) Sản phẩm Dạng III:
(Bài báo; Sách chuyên khảo; và các sản phẩm khác. Tình hình công bố kết quả nghiên cứu
(bài báo, ấn phẩm, ) ở các tạp chí có uy tín trong, ngoài nước và mức độ trích dẫn)
Yêu cầu khoa học cần đạt Số
TT
Tên sản phẩm

Kế hoạch Đạt được
Số lượng, nơi công bố
(Tạp chí, nhà xuất bản)
1 Bài báo trong
tạp chí chuyên
ngành

ngành đào tạo
Theo kế hoạch Đạt được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1 Thạc sỹ 1 1 2009
2 Tiến sỹ 0 1 2012

2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực
và thế giới…)
- Quy trình chuyển gen qua mô phân sinh ở nách lá mầm đậu tương ĐT12 là cơ
sở để chuyển các gen vào các giống đậu tương - đối tượng được cho là tương đối
khó để chuyển gen, nhằm tạo ra những giống đậu tương có phẩm chất tốt, khả năng
chống chịu cao, đáp ứng nhu cầu của sản xuất.
- Hệ thống vector biểu hiện tốt trong hạt thực v
ật sẽ tạo thuận lợi cho việc biểu
hiện các protein tái tổ hợp khác, làm cơ sở cho công nghệ nền farming. Có thể ứng
dụng hệ thống vector này cho các tính trạng khác, như: chống chịu điều kiện bất lợi,
chống chịu sâu bệnh, nâng cao năng suất và chất lượng,….
- Với kết quả sơ bộ về khả năng đáp ứng miễn dịch trên độ
ng vật có thể khẳng
định rằng kháng nguyên biểu hiện trong hạt chuyển gen có khả năng gây đáp ứng

10
miễn dịch qua đường miệng. Kết quả này mở ra một hướng đi mới trong sản xuất
vaccine chống virus cúm H5N1 ở gia cầm nói riêng và vaccine dùng qua đường
miệng nói chung.
- Đào tạo các cán bộ khoa học trẻ nắm vững các kỹ thuật trong việc nghiên cứu

Lần 1 27/3/2009 -Nội dung nghiên cứu còn lớn, cần tổ chức
thực hiện
-Liên hệ với bạn để thực hiện tốt hơn

11
-Giải trình thêm về kinh phí
Người chủ trì
: TS. Nghiêm Xuân Minh –
Vụ trưởng Vụ Khoa học xã hội và tự nhiên
– Bộ Khoa học và Công nghệ
III Nghiệm thu cơ sở 4/2/2010 Bổ sung biên bản nghiệm thu quy trình,
báo cáo tóm tắt, sửa chữa theo phản biện
và hội đồng
Người chủ trì
: PGS. TS. Trương Nam Hải
– Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)
TS. Lê Văn Sơn
Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)


Ti- plasmid Tumor inducing plasmid
v/p vòng/phút
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
YEP Yeast extract peptone

 Báo cáo tổng kết đề tài - Danh sách các thành viên tham gia đề tài
Thời gian thực hiện 2007-2009
iii
DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
STT Họ và tên
Trách nhiệm
trong đề tài
Học hàm,
học vị
Số tháng
làm việc
1 Lê Văn Sơn Chủ nhiệm ĐT TS 18 tháng
2 Lê Trần Bình Thành viên GS. TS 6 tháng
3 Chu Hoàng Hà Thành viên TS 12 tháng
4 Nguyễn Tường Vân Thành viên TS 12 tháng
5 Bùi Phương Thảo Thành viên KS 18 tháng
6 Phan Trọng Hoàng Thành viên CN 12 tháng
7 Ngô Thị Thu Hương Thành viên CN 18 tháng
8 Đoàn Thị Thanh Hương Thành viên ThS 6 tháng

Và một số người khác
 Báo cáo tổng kết đề tài - Mục lục
Thời gian thực hiện 2007-2009
iv
MỤC LỤC

18
2.2.3. Các phương pháp phân tích cây biến nạp
23
2.2.4. Kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch với hạt chuyển gen trên động
vật
24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
30
3.1. TỐI ƯU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG
30
3.1.1 Tối ưu thời gian khử trùng hạt
30
3.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín
32
3.1.3. Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng (GA
3
, IAA) tới khả năng kéo dài
chồi
34
3.1.4. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ
37
3.1.5. Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro
39
3.1.6. Ngưỡng sống sót của cây đậu tương in vitro trên môi trường chứa
kanamycin
41
 Báo cáo tổng kết đề tài - Mục lục
Thời gian thực hiện 2007-2009
v
3.1.7. So sánh khả năng tái sinh phục vụ chuyển gen của 2 giống đậu tương

4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC 78
4.2. KẾT QUẢ NỔI BẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG 79
4.3. ĐÀO TẠO 80
4.4. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 80
4.5. QUYẾT TOÁN KINH PHÍ 81
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
83
TÀI LIỆU THAM KHẢO
85
PHỤ LỤC 











 Báo cáo tổng kết đề tài - Mục lục
Thời gian thực hiện 2007-2009
vi
MỤC LỤC BẢNG

Trang





 Báo cáo tổng kết đề tài - Mục lục
Thời gian thực hiện 2007-2009
vii
MỤC LỤC HÌNH


Trang
Hình 1.1a. Virus cúm với các yếu tố kháng nguyên H và N, lớp màng bao
(envelop), protein liên kết (matrix protein M1), ribonucleoprotein (RNP)
3
Hình 1.1b. Influenza A virus, loại virus gây bệnh cúm gia cầm. (Ảnh chụp những
tiểu phần virus được nhuộm âm tính trên kính hiển vi điện từ truyền qua)
3
Hình 1.2. Mức độ tương đồng của genom virus H5N1 chủng Việt Nam so với các
chủng trong khu vực và trên thế giới
6
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 14
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương 16
Hình 3.1. Hạt nảy mầm sau các thời gian khử trùng khác nhau 31
Hình 3.2. Cụm chồi hình thành trên môi trường có BAP 2 mg/l (SIM4) và 2,5 mg/l
(SIM5)
33
Hình 3.3. Chồi kéo dài trên môi trường có nồng độ GA
3
khác nhau 35
Hình 3.4. Chồi phát triển trong môi trường không có (SEM1) và có (SEM1

Hình 3.26. Cấu trúc gen biểu hiện trong toàn bộ cây 61
Hình 3.27. Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng cắt enzyme hạn chế HindIII 61
Hình 3.28. Kiểm tra dòng A. tumefaciens CV58C1 mang gen biến nạp bằng PCR 62
Hình 3.29. PCR kiểm tra cây Arabidopsis chuyển gen SLHEP 63
Hình 3.30. Kết quả phân tích Southern các dòng cây T0 chuyển gen 64
Hình 3.31. Kết quả phân tích Western các dòng cây T0 chuyển gen 65
Hình 3.32. Hạt của các dòng cây A. thaliana chuyển gen thế hệ T1 được chọn lọc
trên môi trường chứa kháng sinh (A) và trồng trên bầu đất (B)
65
Hình 3.33. Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp SLHEP 66
Hình 3.34. Kết quả chuyển đoạn gen vào cây thuốc lá 66
Hình 3.35. PCR kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen HA, NA và M1 67
Hình 3.36. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong lá cây thuốc lá biến nạp 67
Hình 3.37. Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen 69
Hình 3.38. Kết quả điện di sản phẩm ADN tổng số của các dòng cây chuyển gen 70
Hình 3.39. Kiểm tra cây đậu tương T0 chuyển gen SLHEP (hàng trên) và HA
(hàng dưới) bằng PCR
71
Hình 3.40. Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T1 được trồng trong nhà lưới 71
Hình 3.41. Kiểm tra cây đậu tương T1 chuyển gen SLHEP bằng PCR 72
Hình 3.42. Kiểm tra khả năng ngưng kết hồng cầu của protein hạt cây chuyển
gen
73
Hình 3.43. Kết quả đọc ELISA kháng thể SLHEP trong huyết thanh chuột 74
 Báo cáo tổng kết đề tài – Mở đầu
Thời gian thực hiện 2007-2009
1
MỞ ĐẦU
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao trên khắp thế giới. Hằng
năm dịch cúm đã làm cho nửa tỷ người mắc bệnh, chủ yếu là trẻ em. Hiện nay, cúm

ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác gồm vaccine có thể ăn tươi hoặc nấu
chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồ
ng cây chuyển
 Báo cáo tổng kết đề tài – Mở đầu
Thời gian thực hiện 2007-2009
2
gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine này có tính ổn định an toàn cao, dễ
bảo quản, sử dụng và kinh tế.
Như vậy để tiến tới sản xuất được vaccine ăn được phục vụ cho việc phòng
chống bệnh dịch như dịch cúm gà hiện nay thì cần phải có một chiến lược, một kế
hoạch nghiên cứu để đưa ra quy trình công nghệ sản xuất. Trong những năm gầ
n
đây, với sự phát triển của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ tế bào thực
vật nói riêng, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã thành công tạo ra một số sản
phẩm y dược trong cây trồng chuyển gen.
Từ sự cấp thiết của tình hình hiện nay và trên cơ sở một số thành công trong
tạo cây chuyển gen trên một số cây trồng, chúng tôi hợp tác với trường Đại học Tự
do (Vương quốc Bỉ
) tiến hành thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu phát triển vaccine
thực vật dùng qua đường miệng cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt
Nam”.
 Báo cáo tổng kết đề tài – Chương 1. Tổng quan tài liệu
Thời gian thực hiện 2007-2009
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÚM VÀ VIRUS CÚM H5N1
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao trên khắp thế giới. Hằng
năm dịch cúm đã làm cho nửa tỷ người mắc bệnh, chủ yếu là trẻ em (Bardiya et al.,
2005). Hiện nay, cúm H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất hiện nay đã lan truyền
trên 40 quốc gia ở Châu Á, Trung Đông, Châu Âu và Châu Phi. Chủng này mới

Gần đây, người ta phát hiện thêm 1 subtype HA mới (H16) từ chim hải âu đầu đen
tại Thuỵ Điển. Các subtype này gây nhiễm cho hầu như phần lớn mọi loài sinh vật
bao gồm các loài lông vũ (gà và thuỷ cầm), lợn, ngựa, chim, chồn đất, hải cẩu, cá
voi và loài ngườ
i.
Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virus cúm A có 8 phân
đoạn, có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide. Phân đoạn 1-3 mã hoá cho
protein PB1, PB2 và PA; có chức năng là enzym polymerase, điều khiển tổng hợp
ribonucleic acid nguyên liệu cho hệ gen và RNA thông tin. Phân đoạn 4 mã hoá cho
HA là protein “độc”, mang tính gây bệnh, có tính kháng nguyên và có khả năng
ngưng kết với hồng cầu gà. Phân đoạn 5 mã hoá cho nucleoprotein (NP), là protein
có trách nhiệm bao bọc hệ gen. Phân đoạn
6 là gen chịu trách nhiệm tổng hợp
protein NA, cắt thụ thể giải phóng virus khỏi tế bào, sau chu kỳ nhân lên của chúng.
Phân đoạn 7 mã hoá cho 2 tiểu phần protein đệm M1 và M2 (matrix protein), có
chức năng tập hợp virus và tạo kênh chuyển vận i-on qua màng nhân. Phân đoạn 8
mã hoá cho 2 tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2 (non-structural
protein), đa chức năng.
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÚM H5N1 Ở VIỆT NAM
Dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra ở nước ta từ nh
ững tháng cuối năm 2003 với
các đợt dịch cao điểm vào các tháng đầu năm 2004, đầu năm 2005, cuối năm 2005
và đầu năm 2006, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm, trong đó
trên 50 triệu (2004) và trên 2 triệu gia cầm (2005) đã bị tiêu huỷ và đã gây thiệt hại
lớn cho người với 92 người mắc bệnh, trong đó đã có 43 trường hợp tử vong
(WHO).
Ngay sau khi dịch cúm xảy ra, Bộ Chính trị đã ban hành Chỉ
thị số 35-
CT/TW, ngày 06-02-2004 về triển khai các biện pháp cấp bách ngăn chặn dịch cúm
gia cầm và cúm A (H5N1) trên người. Tổ chức Y tế thế giới và các nhà khoa học đó