BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
–––––––––––––––––––––––––––––––
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN
PSEUDOMONAS TRONG HỆ THỐNG LỌC SINH HỌC ĐỂ
XỬ LÝ NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP CHẾ BIẾN SỮA”
Chủ nhiệm Đề tài: CAO XUÂN THẮNG


1.4.4 Hệ thống lọc sinh học 17
1.4.5 Chất mang và các phương pháp cố định tế bào 26
2
II. THỰC NGHIỆM 34
2.1 Phương pháp tiến hành nghiên cứu 34
2.1.1 Môi trường nuôi cấy 34
2.1.2 Phương pháp lấy mẫu 34
2.1.3. Phương pháp phân lập 35
2.1.4 Phương pháp xác định hình thái bào tử, tinh thể 35
2.1.5 Phương pháp đếm số lượng bào tử 35
2.1.6 Các phương pháp xác định các chỉ tiêu nước thải 35
2.1.7 Môi trường thử hoạt tính enzim vi sinh vật 36
2.1.8 Phương pháp định tên vi sinh vật 37
2.1.9 Phương pháp bảo quản vi sinh vật 38
2.1.10 Phương pháp xác định hoạt lực enzim 39
2.2 Dụ
ng cụ, thiết bị và hóa chất 40
2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 40
2.2.2 Nguyên vật liệu và hóa chất 41
2.3 Kết quả thực nghiệm 42
2.3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng Pseudomonas 42
3
2.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và bảo quản chủng
Pseudomonas

2 BOD Nhu cầu oxi sinh hoá (Biochemical oxygen Demand)
3 SS Chất rắn lơ lửng (Suspended solid)
4 DO Oxi hòa tan (Dissolved oxygen)
5 ĐC Đối chứng
6 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam 5
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1 Các phương pháp cố định tế bào 31
Hình 2 Sản phẩm PCR gen 16S rDNA của các chủng 47
Hình 3 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến sự tổng hợp
proteaza
54
Hình 4 Ảnh hưởng của hàm lượng MgCl
2
đến sự tổng hợp
proteaza
56
Hình 5 Ảnh hưởng của hàm lượng K

Bảng 3 Khả năng sinh tổng hợp enzim proteaza của các chủng
giống
44
Bảng 4 Đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu 46
Bảng 5 Phân loại các chủng dựa trên trình tự phân đoạ
n của 16S
rDNA
50
Bảng 6 Hoạt lực enzym proteaza của các chủng Pseudomonas 51
Bảng 7 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến hoạt lực của enzim 53
Bảng 8 Ảnh hưởng của pH đến quá trình tổng hợp proteaza 59
Bảng 9 Kết quả bảo quản chủng Pseudomonas monteilii bằng
phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng và
định kỳ cấy truyền
61
Bảng 10 Kết quả bảo quản chủng Pseudomonas monteilii bằng
phương pháp đông khô
62
7
Bảng11 Ảnh hưởng chất mang PU, PS, PVC đến hiệu suất quá trình
xử lý
66
Bảng 12 Ảnh hưởng chất mang PU, PS, PVC đến số lượng tế bào vi
sinh vật
67
Bảng 13 Ảnh hưởng thời gian đến số lượng tế bào Pseudomonas
monteilii

1.2 TÍNH CẤP THIẾT, MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây, công nghiệp Việt Nam nói chung có bước phát
triển mạnh. Tỉ
trọng công nghiệp trong nền kinh tế chiếm 41,25% (2005) tăng
lên 42,2 % (2007) và mục tiêu sẽ đạt 44% (2020). Trong đó các ngành chế biến
thực phẩm đóng góp một phần không nhỏ. Ngành công nghiệp chế biến sữa là
một trong những ngành có tốc độ phát triển mạnh nhất. Sự phát triển của ngành
này kéo theo rất nhiều tác động tích cực tới các ngành công, nông nghiệp có liên
quan: chăn nuôi, chế biến thức ăn gia súc, thú ý… giải quyết được một lượ
ng lớn
lao động cho xã hội và đóng góp vào sự phát triển chung của nền kinh tế. Tuy
vậy, tác động tiêu cực về mặt môi trường do ngành này mang lại cũng rất lớn.
Với đặc thù chung của ngành công nghiệp chế biến thực phẩm là tiêu thụ một
lượng lớn nước, ngành chế biến sữa còn thải ra nước thải có mức độ ô nhiễm
hữu cơ rất cao. Bên cạnh đó, các công trình nghiên cứu và triể
n khai các dự án
về xử lý nước thải của Việt Nam còn hạn chế. Các công nghệ xử lý khác nhau
thường dựa trên cơ sở công nghệ xử lý kị khí, hiếu khí, liên tục hoặc gián đoạn…
đã và đang được áp dụng, nhưng nhìn chung đều chưa hoàn chỉnh, khả năng xử
lý chưa cao và vẫn đang ở trong giai đoạn vừa nghiên cứu vừa ứng dụng thử
nghiệm.
9
Phương pháp lọc sinh học là một trong những phương pháp xử lý nước
thải có nhiều ưu điểm nổi bật, hiện đang là mối quan tâm của các nhà khoa học.
Phương pháp này có khả năng xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ cao, thời gian lưu
thủy lực ngắn, tạo điều kiện cho hệ vi sinh vật dễ thích nghi với nước thải, quản
lý vận hành đơn gi

1.3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1.3.1 Đối tượng và phạm vi
- Đối tượng nghiên cứu: vi sinh vật phân lập từ nước thải, đất (cống,
xưởng sản xuất bia, sữa, sông), chất mang cho vi sinh vật, hệ thống xử lý nước
thải
- Phạm vi: Các chủng Pseudomonas, các nhà máy chế biến sữa.
1.3.2 Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Pseudomonas có hoạ
t lực cao trong
xử lý nước thải
- Nghiên cứu lựa chọn chất mang và giải pháp cố định các vi khuẩn
Pseudomonas lên các chất mang phù hợp trong hệ thống lọc sinh học xử lý nước
thải
- Bước đầu đánh giá hiệu quả xử lý nước thải chế biến sữa của hệ thống
lọc sinh học có cố định vi khuẩn Pseudomonas so với các phương pháp truyền
thống.
1.4 TỔ
NG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI
NƯỚC
1.4.1 Tình hình ô nhiễm do các ngành công nghiệp thực phẩm tại Việt Nam
Hiện trạng ô nhiễm môi trường của Việt Nam trong thời gian gần đây đã
đến mức phải báo động. Sự phát triển không đồng bộ giữa cơ sở sản xuất công
nghiệp và các cơ sở hạ tầng đi kèm như: hệ thống thoát nước, hệ thống thu gom
nước thải, hệ thống xử
lý nước thải…đã làm cho môi trường nước tại các khu
vực sản xuất công nghiệp đang ngày bị ô nhiễm trầm trọng hơn.
11
12
Hiện nay, công nghệ xử lý nước thải đang được quan tâm và nghiên cứu
rộng rãi tại nhiều nước trên thế giới. Trong hệ thống cấp nước công nghiệp, xử lý
nước thải triệt để còn tăng khả năng tuần hoàn lại nước thải để sử dụng cho quá
trình sản xuất. Để xử lý nước thải triệt để, có rất nhiều phương pháp, một trong
nh
ững phương pháp ưu việt là phương pháp lọc sinh học sử dụng hệ vi sinh bám
dính. Nghiên cứu tại Đại học Xây dựng Mát-xcơ-va (MGSU), Liên bang Nga
cho thấy phương pháp này có thể loại bỏ phốt-pho ra khỏi nước thải sinh hoạt
bằng hệ vi sinh bám dính dựa trên nguyên tắc ăn mòn sinh học. Bể lọc sinh học
thường được ứng dụng rộng rãi cho quá trình loại bỏ ammonia nitrogen (NH
4
+
)
hay là quá trình nitrat hoá (nitrification). Sử dụng hệ vi sinh bám dính còn có thể
loại bỏ được kim loại nặng ra khỏi nước thải. Tại Trung tâm công nghệ sinh học
GBF, Brauschweig, Đức người ta đã sử dụng các chủng vi sinh vật dòng
Psedomonas để xử lý nước thải công nghiệp hoá chất có nồng độ thuỷ ngân lớn
và cho hiệu quả xử lý cao.
Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, người ta thấy rằng chủng vi khuẩn
Pseudomonas là chủng vi khu
ẩn rất có ích trong việc xử lý nước thải. Nó có thể
làm giảm chỉ số COD của nước thải bằng cách phân hủy các hợp chất hữu cơ,
benzen, naphtalen và pyridin Nghiên cứu và ứng dụng hệ vi sinh bám dính để
xử lý triệt để nước thải sinh hoạt và công nghiệp mở ra các khả năng mới trong
việc giảm thiểu các chỉ tiêu như BOD, SS, N, P và thậm chí là kim loại nặng (ví
dụ như thuỷ ngân Hg) xuống dưới n
ồng độ cho phép (Hany, 2004; Cansten,

S…). [9]
Trong nước thải sinh hoạt, nước thải của các xí nghiệp chế biến nông sản,
thực phẩm, thuỷ sản, các trại chăn nuôi… rất giàu các chất hữu cơ, gồm 3 nhóm
chính: protein 40÷50%, hydratcacbon 50% và chất béo 10%. Protein là polyme
của các axitamin, là nguồn dinh dưỡng chính cho vi sinh vật. Hydratcacbon bao
gồm các loại đường, tinh bột và xenluloza. Tinh bột và đường rất dễ bị phân huỷ
bởi vi sinh vật, còn xenluloza thì khó bị phân hủy hơn và tốc độ phân huỷ cũng
chậ
m hơn. Chất béo ít tan trong nước thải và vi sinh vật cũng khó phân giải. Các
vi sinh vật muốn phân huỷ được các chất hữu cơ phải có khả năng sinh tổng hợp
các enzim tương ứng. Mỗi loại nước thải có một khu hệ vi sinh vật đặc trưng
14
riêng. Nước thải sinh hoạt chứa phân, nước rửa, tắm giặt, thức ăn thừa chứa rất
nhiều vi khuẩn, trung bình từ vài triệu đến vài chục triệu cá thể trong 1 mi-li-lít.
Các vi sinh vật hoại sinh có trong nước thải là các vi khuẩn hiếu khí, kị khí hoặc
kị khí tuỳ tiện, trong đó điển hình là các chủng vi khuẩn: Pseudomonas, Bacillus,
Alcaligenes, Lactobacillus, Flavobacterium, Cytophaga, Clostridium. Trong số
này, giống
Pseudomonas thường gặp ở hầu hết các loại nước thải. Pseudomonas
hầu như có thể đồng hoá được mọi chất hữu cơ, kể cả các hợp chất hữu cơ tổng
hợp và tồn tại khá lâu trong môi trường nước thải [9].
Pseudomonas là những trực khuẩn gram (-), chuyển động do có tiên mao
mọc ở một đầu. Trực khuẩn có thể là hình que thẳng hoặc hơi cong, không tạo
thành bào tử và phát triển ở điều kiện hiếu khí. Nhiều loại của giống này ưa lạnh,
nhiệt độ tối thiểu là -2
o
C đến 5

chỉ tiêu như BOD, SS, N, P xuống dưới nồng độ cho phép.
Sử dụng hệ vi sinh bám dính còn có thể loại bỏ được kim loại nặng ra khỏi
nước thải. Trung tâm công nghệ sinh học GBF (Brauschweig, Đức) đã nghiên
cứu thành công công nghệ loại bỏ Hg
2+
khỏi nước thải xí nghiệp hoá chất bằng vi
sinh vật chịu được thuỷ ngân. Tác giả đã chỉ ra rằng, các chủng vi sinh vật dòng
Pseudomonas được cấy lên các vật liệu bám dính của bể phản ứng sinh học
(bioreactor) đã xử lý thuỷ ngân đạt 97% với thời gian xử lý 10 giờ [42].
1.4.3 Tình hình nghiên cứu ở trong nước
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu công nghệ xử lý nước thải còn rất
hạn chế, mộ
t số mảng còn chưa được nghiên cứu sâu. Rất nhiều đơn vị nghiên
cứu tham gia vào lĩnh vực này, đưa ra các công nghệ xử lý nước thải khác nhau
trên cơ sở xử lý hiếu khí và kị khí, liên tục hoặc gián đoạn đã triển khai ứng
dụng tại nhiều cơ sở. Tuy nhiên, mỗi công nghệ đều có những điểm mạnh, điểm
yếu khác nhau, nhưng nhìn chung các công nghệ này đều chưa hoàn ch
ỉnh,
thường vừa nghiên cứu vừa ứng dụng thử nghiệm.
Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas đã được nghiên cứu ở nhiều lĩnh vực
khác nhau. Khoa Nông học - Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
16
Minh đã áp dụng thành công chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens P217 để
đối kháng với dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh ở cà chua, khoai tây, ớt. Năm
2006, tác giả Cao Ngọc Điệp và cộng sự đã nghiên cứu thành công ứng dụng
Pseudomonas spp. trong phân bón nhằm nâng cao trữ lượng đường trong cây
mía. Năm 2006 tác giả Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cộng sự đã nghiên cứu ứng

bám dính ít hơn nhiều so với hệ bùn hoạt tính lơ l
ửng, do đó chi phí để xử lý bùn
cũng ít hơn. Các công trình xử lý dùng hệ vi sinh bám dính cũng gọn nhẹ và dễ
hợp khối, mở ra triển vọng ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là đối với các công trình
xử lý vừa và nhỏ trong dân dụng và công nghiệp.
1.4.4 Hệ thống lọc sinh học
a) Lọc sinh học
Trong khi việc sử dụng các hệ thống lọc sinh học chưa được phổ biến ở
M
ỹ thì hàng trăm hệ thống lọc sinh học đã được ứng dụng rất thành công và có
hiệu quả ở Châu Âu (Hà Lan, Tân Tây Lan, Đức) và Nhật Bản [9]. Hệ thống lọc
sinh học trước đây thường được thiết kế để xử lý mùi của các hệ thống xử lý
nước thải, các nhà máy tái chế, quá trình ủ phân compost. Sau đó, nó được ứng
dụng phổ biến trong việc xử lý các hợp chất hữu cơ
dễ bay hơi và các hợp chất
hữu cơ khác. Ở Việt Nam, phương pháp lọc sinh học là một biện pháp xử lý ô
nhiễm tương đối mới. Các nghiên cứu về vấn đề này còn rất hạn chế.
Nguyên tắc chính của hệ thống xử lý là tạo điều kiện cho vi sinh vật tiếp
xúc với các chất ô nhiễm hữu cơ có trong nước thải. Trong hệ thống này, các vi
sinh vật (chủ yế
u là vi khuẩn) sẽ tạo thành một màng sinh học (biofilm), đây là
một màng mỏng và ẩm bao quanh các nguyên liệu lọc. Các vi khuẩn hiếu khí
được tập trung ở phần lớp ngoài của màng lọc sinh học. Ở đây chúng phát triển
18
và gắn kết vào giá mang là các vật liệu lọc (được gọi là sinh trưởng gắn kết hay
sinh trưởng bám dính) [9].
Trong quá trình vận hành, các vật liệu lọc tiếp xúc với nước chảy từ trên


19
thành lớp mỏng qua khe hở của vật liệu,
đồng thời tiếp xúc với màng sinh học ở
trên bề mặt vật liệu. Vi sinh vật trên lớp
màng sinh học phân hủy hiếu khí và kị
khí các chất hữu cơ có trong nước. Các
chất hữu cơ bị phân hủy hiếu khí sinh ra
CO
2
và nước, phân hủy kị khí sinh ra
CH
4
và CO
2
làm tróc màng ra khỏi vật
mang, bị nước cuốn theo. Trên bề mặt
giá mang (vật liệu lọc) lại hình thành
lớp màng mới. Hiện tượng này được lặp
đi lặp lại nhiều lần. Kết quả là BOD của
nước thải giảm xuống do bị vi sinh vật
sử dụng làm chất dinh dưỡng
sẽ tiếp xúc với lớp vật liệu lọc. Ở đây
sẽ diễn ra qua trình phân hủ
y các
chất hữu cơ có trong nước thải bởi
các vi sinh vật của màng lọc. Lớp
màng sinh học bám quanh các hạt vật
liệu lọc ít bị tróc.
- Ưu điểm:

+ Dễ bị tắc nghẽn hệ thống
+ Rất nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ
+ Khó khống chế được quá trình thông
khí, dễ bốc mùi
+ Bùn dư không ổn định
+ Nước sau khi xử lý ở lọc sinh học
thường nhiều chất lơ lửng do các mả
nh
vỡ của màng sinh học cuốn theo, vì vậy
cần phải đưa vào lắng 2 và lưu ở đây
thời gian thích hợp để lắng cặn
- Nhược điểm
+ Làm tăng tổn thất tải lượng, giảm
lượng nước thu hồi
+ Tổn thất khí cấp cho quá trình, vì
phải tăng lưu lượng khí không chỉ
đáp ứng cho nhu cầu của vi sinh vật
mà còn cho nhu cầu cơ thủy lự
c
+ Phun khí mạnh tạo nên dòng
chuyển động xoáy làm giảm khả
năng giữ huyền phù.
Ưu và nhược điểm của hệ thống lọc sinh học
* Ưu điểm:
21
• Ưu điểm chính là đầu tư ít, giá vận hành thấp, sử dụng hóa chất không
nhiều.

dưới lọc hướng lên phía trên được tiếp xúc với vật li
ệu. Trên mặt các loại vật liệu
có vi sinh vật kị khí và tùy tiện phát triển dính bám thành màng mỏng. Lớp màng
này không bị rửa trôi, thời gian lưu lại của lớp màng trên bề mặt chất mang có
thể tới 100 ngày. Do vậy, bể lọc kị khí thích hợp cho việc xử lý nước thải có độ ô
nhiễm thấp ở nhiệt độ không khí ngoài trời. Trong bể lọc các chất hữu cơ khi tiếp
xúc với màng bám dính trên bề mặt v
ật liệu sẽ được hấp thu và phân hủy. Bùn
cặn được giữ lại trong khe rỗng của lớp lọc. Sau 2-3 tháng làm việc nên xả bùn 1
lần và thau rửa lọc vật liệu mang [9].
b) Sinh trưởng bám dính
Trong quá trình xử lý sinh học, các vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ
phát triển thành màng (biofilm) dính bám hay gắn kết vào các vật liệu trơ như
đá, xỉ, gỗ, sành sứ, chất dẻo.
Trong dòng nước thải có những vật rắn làm giá
đỡ (giá mang), các sinh
vật (chủ yếu là các vi khuẩn) sẽ bám trên bề mặt. Trong số các vi sinh vật có
những loài sinh ra các polysacarit có tính chất như là các chất dẻo (gọi là polyme
sinh học), tạo thành màng (màng sinh học). Màng này cứ dầy dần thêm và thực
chất đây là sinh khối vi sinh vật dính bám hay cố định trên các chất mang. Màng
này có khả năng oxi hóa các chất hữu có trong nước khi chảy qua hoặc tiếp xúc,
ngoài ra màng này còn khả năng hấp thụ các chất bẩn lơ lửng hoặc trứ
ng giun
sán… [9].
23
Như vậy, màng sinh học là tập hợp các loài vi sinh vật khác nhau, có hoạt
tính oxi hóa các chất hữu cơ có trong nước khi tiếp xúc với màng. Mầu của màng

hệ vi sinh vật trong màng sinh học của phin lọc là các thể tùy tiện [9]. Màng sinh
học này được dùng trong các phin lọc sinh học hiếu khí hoặc đĩa quay sinh học.
Phần dưới cùng của màng là lớp quần thể vi sinh vật với sự có mặt của
động vật nguyên sinh và một số sinh vật khác. Các loài này ăn vi sinh vật và sử
dụng một phần màng sinh học để làm thức ăn tạo thành các lỗ nhỏ của màng trên
bề m
ặt chất mang. Quần thể vi sinh vật của màng sinh học có tác dụng như bùn
hoạt tính.
Nhìn chung ở vùng trên cùng của phin lọc có sinh khối nhiều nhất và
màng lọc cũng dầy nhất, ở vùng giữa ít hơn và vùng dưới ít nhất. Màng vi sinh
vật sẽ tăng dần lên và dầy thêm, các tế bào bên trong màng ít tiếp xúc với cơ chất
và ít nhận được oxi phải chuyển sang phân hủy kị khí. Sản phẩm của biến đổi kị
khí là các axit hữ
u cơ, các alcol… Các chất này tạo ra chưa kịp khuyếch tán ra
ngoài đã bị các vi sinh vật khác sử dụng và nước lọc qua phin không ảnh hưởng
gì lớn.
Với đặc điểm như vậy, màng sinh học có thể oxi hóa được tất cả các chất
hữu cơ dễ phân hủy trong nước thải. Màng này dần dần bịt các khe giữa các hạt
cát, phin lọc giữ lại các tạp chất, các thành phần sinh học có trong nước làm cho
v
ận tốc nước qua lọc chậm dần và phin làm việc có hiệu quả hơn. Nó hấp thụ giữ
lại các vi khuẩn cũng như các tạp chất, oxi hóa các chất hữu cơ trong nước và
nước dần dần được làm sạch. Nếu lớp màng quá dày ta có thể nước rửa, sục
nước để loại bỏ màng và phin sẽ chảy nhanh hơn, hiệu quả của lọc có giảm
nhưng dần dầ
n lại được hồi phục. Hiệu quả của phin lọc chậm có thể giữ được
tới 99% vi khuẩn có trong nước [9].