Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 1
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
1.1. Đặt vấn đề
Kim Ngân hoa (Lonicera japonica Thunb) thuộc Họ Kim Ngân
(Caprifolianceae) là cây dược liệu chứa tanin và một saponin. Hoa chứa một
flavonoid là scolymosid lonicerin và một số carotenoid (ε. caroten, cryptoxanthin,
auroxanthin). Quả mọng giàu carotenoid mà phần lớn là cryptoxanthin. Lá chứa
một glucosid gọi là loganin và khoảng 8% tanin.
Theo Y học cổ truyền: Kim Ngân Hoa có tác dụng thanh nhiệt giải độc.
Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại chứng minh cây thuốc Kim Ngân
Hoa có tác dụng: kháng khuẩn, chống viêm, làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và
làm tăng tác dụng thực bào của bạch cầu, tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh
cường độ bằng 1/6 của cà phê, làm hạ cholesterol trong máu, tăng bài tiết dòch vò
và mật.
Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp khuyếch
tán và hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tác
dụng kháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dòch hạch, thương hàn, cận
thương hàn, liên cầu khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả. Tác dụng yếu hơn đối với
các trực khuẩn bạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng. Nước sắc lá Kim
Ngân với nồng độ 201,2% ức chế trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chế
trực khuẩn cận thương hàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn
(Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam).
Mặc khác, Kim Ngân cũng là dược liệu quý được dùng điều trò ung thư trong
Đông và Tây y như ung thư tuyến vú, gan, vòm họng, cổ tử cung, u bướu giáp
trạng, trực tràng,
Ngoài tác dụng hoa lá làm thuốc, ứng dụng trong mỹ phẩm, cho cảnh đẹp,
hoa thơm, mành che nắng và mái che nắng, Kim Ngân còn có tác dụng hấp thu
nhiệt của ánh nắng mặt trời (cho cây quang hợp và phát triển) nên mát hơn mành
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 2
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Như vậy với giá trò to lớn của cây Kim Ngân, là cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 3
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Nam trong tình hình dược liệu của nước ta hiện nay nói chung và Kim Ngân nói
riêng thì việc đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô theo quy mô
công nghiệp để có thể nâng cao năng suất và số lượng cây trồng trong thời gian
ngắn nhất đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ cho thò trường Việt Nam và trên thế giới
là điều hết sức cần thiết.
1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục đích
Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro.
Đồng thời tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trò
dược lý trong cây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp
dược.
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng đến mẫu cấy
lá của cây Kim Ngân.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 4
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 5
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
2.1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1. Khái niệm
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác đònh ở
điều kiện vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối
khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002).
2.1.2. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghóa vô cùng to lớn đối với
nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trò đóng góp trực tiếp cho
Kiểm soát được dòch bệnh cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô
hay nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm
bệnh hay mang mầm bệnh.
Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của
giống đem vào sản xuất.
Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu
hoạch.
Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm
cuối. Sự đồng loạt này sẽ giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu
hoạch. Do đó, năng suất lao động sẽ tăng lên. Chất lượng sản phẩm đồng
nhất, tạo điều kiện cho khâu tiêu thụ và chế biến.
Tóm lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn
trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Đây thực sự đã và đang là cuộc cách
mạng xanh trong ngành trồng trọt.
2.1.3. Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp nhân giống in vitro
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 7
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Một số thuận lợi của phương pháp nhân giống in vitro (Pierik, 1975,
Anonymous, 1980; van Assche, 1983; Gebhard và cộng sự, 1983; Kunneman-
Kooij, 1984):
Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.
Có thể tái sinh được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo và
sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn
do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô và tạo được
cây sạch bệnh vì có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa mẫu vào
nuôi cấy, đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầm
bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Các cây sạch bệnh này có thể
được trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau do cây có kích thước nhỏ và
không trồng trong đất.
Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho
Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá
thành của cây tăng lên.
2.1.4. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lónh
vực như:
Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp
(nuôi cấy tế bào trần).
Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tế
bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid,
glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp
thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong
nông nghiệp.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 9
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây
con thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).
Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn).
Vi nhân giống những giống cây có giá trò khoa học và thương mại.
Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.
Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử.
Nuôi cấy quang tự dưỡng.
2.1.5. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô
Bảng 2.1. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô
Nguồn gốc mẫu cấy Kích thước Mẫu được tách
Đỉnh sinh trưởng
0,5 – 1 mm Tế bào đỉnh sinh trưởng
Chồi đỉnh
0,5 – 1 cm
Chốp đỉnh có chứa một
phần thân
điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ.
Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy
vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm
rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy.
+ Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa
mẫu bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy.
+ Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dòch khử trùng để khử
các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dòch thường được sử dụng để
khử trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium,
oxy già, nitrate bạc, dung dòch bromine, chlorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20
(polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dòch khử trùng thì sẽ làm tăng
hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật như
vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn.
+ Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùng
trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những
phần bò tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích
thước thích hợp.
+ Mẫu thực vật thường bò nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cách
bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu
bằng các chất này trước khi khử trùng.
+ Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ
khi bắt đầu nuôi cấy. Khi bò hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bò ức chế và lâu
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 11
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
ngày mẫu sẽ chết. Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa một
lượng lớn tannin hoặc các hợp chất hydroxyphenol. Các mô non thường ít bò hóa
nâu hơn mô trưởng thành hay mô già. Hiện tượng hoại tử hoặc hóa nâu là do hoạt
động của enzyme oxidase có nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và
tryosinase), nó được tổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt
quá trình cắt và khử trùng mẫu.
Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA
3
và
các chất hữu cơ khác.
2.1.6.3. Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.
Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống với
môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp
với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình
tăng sinh được nhanh. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được
duy trì trong thời gian vô hạn.
2.1.6.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bò
chuyển ra vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi
ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào
đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với điều
kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều
kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ
C/N, ánh sáng, sự trẻ hòa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin
để kích thích quá trình ra rễ in vitro.
2.1.6.5. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm
Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in
vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn đònh về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 13
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
ẩm… Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh
dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ
dàng bò stress, dễ mất nước và mau héo.
Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng
một số cơ chất khác vào trong môi trường,…
Những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô
rất phức tạp, chúng ta không thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần
lưu ý đến một số vấn đề sau:
Quá trình tái sinh phức tạp do chòu sự tương tác của nhiều nhân tố khác
nhau (môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh
trưởng,…).
Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loài
khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau.
Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loài
khác nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai trò
quyết đònh do đó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng không
nhiều.
Sự hình thành rễ bất đònh thường đối lập với sự hình thành chồi bất đònh.
Nếu cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang
nhiều thiếu sót. Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo
chồi bất đònh trước sau đó cảm ứng tạo rễ.
2.1.7.1. Sự hình thành chồi bất đònh
Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất đònh như một phương pháp nhân
giống vô tính nhằm làm tăng số lượng cây mong muốn.
Các loại cây thường được áp dụng phương pháp này để nhân giống ví dụ như:
Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lily, lan dạ hương, Nerin…
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 15
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Có nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất đònh và tạo rễ bất đònh:
Sự hình thành chồi bất đònh ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng
các bộ phận của cây con (Anonymous, 1984).
Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và
rễ).
Sự hình thành chồi và rễ đều bò ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.
Chúng ta có thể kết luận rằng ở những loài cần cytokinin và auxin cho sự tái
sinh chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin. Tỉ lệ của hai
chất điều hòa sinh trưởng này sẽ quyết đònh sự hình thành cơ quan (Skoog và
Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953). Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúc
đẩy tạo chồi ở nhiều loài thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuất
hiện nhiều biến dò (chồi biến dạng).
Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ
tăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1957; Nitsh và cộng sự, 1969). Một số
trường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm ứng tạo chồi:
Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948).
Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex
(Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic ức
chế sự hình thành chồi bất đònh mặc dù vẫn có trường hợp cảm ứng sự hình thành
chồi như ở cây Ipomoea batatas.
2.1.7.2. Sự hình thành rễ bất đònh
Rễ bất đònh được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô của
chúng còn giữ khả năng phân sinh.
Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót
của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 17
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất đònh: đặc điểm di truyền
của loài, tuổi của mẫu, vò trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết
thương, số lần cấy chuyển, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh
trưởng, than hoạt tính, đường, agar, pH,…
2.1.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi
cấy in vitro
2.1.8.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển in vitro:
sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và
cộng sự, 1974), Primula obconica ( Coumans và cộng sự, 1979).
Tình trạng sinh lý
Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào
in vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh
hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn
sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957). Các
chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro
hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi
chúng bắt đầu phát triển).
Vò trí của mẫu cấy trên cây
Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vò trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và
phát triền in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ông nhận thấy
những chồi ban đầu được tách từ những vò trí thấp trên cây phát triển trong môi
trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự hình
thành các giả hành bất đònh của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 19
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra tương tự đối với Lily
(Robb, 1957). Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có
nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng
in vitro giống nhau.
Kích thước mẫu cấy
Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để
tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời khỏi
cây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thước
càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất
dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro
hơn những cơ quan ít chất dự trữ. Đối với những mẫu bò cắt, phần trăm bề mặt bò
tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh hưởng của vết thương lên
cần phải cung cấp là N, P, K¸Ca, Mg và Fe.
Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in
vitro là lónh vực còn ít nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra
đời, người ta không nghó đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường
nuôi cấy. Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hóa chất dùng để
pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung
cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp
cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo
Carbon và nguồn năng lượng: trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp
mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh
khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính từ nguồn carbon bổ sung vào
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 21
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và
sucrose. Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như
lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này
có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. Sucrose là một nguồn carbon
quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy.
Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng
trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình
biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài
vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng. Các vitamin
thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid
nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol.
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượng cao
chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như
các chất diệt cỏ dại.
Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế
bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều
Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình
thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất đònh. Auxin cũng ức chế sự phát triển của
chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo.
Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng.
Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các
quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng
được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non. Nhưng trong quá trình vận
chuyển này, chúng bò oxy hóa do hoạt động của các enzyme auxin – oxidase,
điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng.
Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ
Thò Bạch Mai, 2004).
Cytokinin
Cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin và 2iP) được phát hiện sau auxin và
gibberellin. Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin
sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin
là các hợp chất adenin được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến
là zeatin và IPA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều
nhất trong nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 23
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi có sự hiện diện của
auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinin cho phép
tách rời nhiễm sắc thể.
Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ
sự thành lập chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ.
Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống
lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa. Các chồi nách
được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn.
Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào
và đònh hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi
Tất cả các bộ phận của cây đều có khả năng tổng hợp etylen, quan trọng nhất
là trái cây, kém hơn là hoa và ở các cơ quan thực vật bò chấn thương.
Abscisic acid
Acid abscisic (ABA), một loại hormone thực vật gây nên sự rụng lá và quả
cũng như sự miên trạng thường được sử dụng trong nuôi cấy phôi.
Hoạt động trên sự thẩm thấu của tế bào đối với ion potassium (K
+
), do tác
động này nó đã ảnh hưởng trên sự đóng mở khí khổng của tế bào.
Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuôi cấy bằng chu kỳ sáng thích
hợp, nó có thể bò ức chế hoàn toàn (như cây Volubilis) hoặc từng phần bò ức chế
(như cây Chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây Plumbago).
Áp dụng trên các cây dài ngày, nó có thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng
thuận lợi (như cây Epinard, Lolium temulentum).
Trong nuôi cấy mô, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây
và phần khác tùy các điều kiện nuôi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rất
khác nhau và giải thích một cách khó khăn.
Tóm lại, trong nuôi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự
cân bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính mà vai trò
tạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin. Theo Skoog:
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 25
Copyright: Tài liệu đại học ©