THỰC HÀNH
Môn CNSH trong BVTV
Bài 1. PCR phát hiện begomovirus
1. Giới thiệu
Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb.
Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm
hai phân tử DNA-A và DNA-B)
2. Mồi PCR
Sử dụng một cặp mồi chung (degenerate primers) được thiết kế ở vùng bảo thủ của
phân tử DNA-A để phát hiện virus
Mồi Trình tự (5’ – 3’) Vị trí
Kích thước
(bp)
Tham khảo
BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC
*
Hình 2
~1200
BegoARev1 ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC
*
* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T) và i = inosine
DNA-A
~2.7kb
AC4
AC2 (TrAP)
AC1 (Rep)
(Rep)
AV1 (CP)
AC3 (REn)
AV2
(CEGPCKVQS)

NaOH 3M (1 ngày), rửa lại bằng nước cất rồi hấp vô trùng.
7. Tube 1,5ml
8. Bút viết kính
9. Pipet (1000, 200) và tip
10. Máy li tâm để bàn (15000 g)
11. Bể nhiệt
Quy trình chiết
1. Ủ đệm chiết CTAB (cứ 1 mẫu chiết cần 1ml đệm) đã bổ sung BME (với tỉ lệ 1ml
đệm CTAB :10 μL BME) trong bể nhiệt ở nhiệt độ 60
o
C trong 30 phút.
2. Lấy 0,1 g mô lá bệnh nghiền với 1ml CTAB bằng chày cối sứ (nghiền đến khi
dung dịch thu được là một thể đồng nhất). Hút 700 mL dịch chiết cho vào tube 1,5
ml.
3. Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch trên tủa (600 μL) cho vào tube mới
4. Cho Chloroform: Isoamylalcolhol (24 :1) vào tube với tỉ lệ thể tích tương đương.
Đảo đều tube.
5. Li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trên tủa (400 μL).
6. Lặp lại các bước 3, 4, 5 thêm một lần nữa.
7. Cho thể tích tương đương (400 μL) 2-propanol vào tube. Đảo đều tube và để lạnh
(-20 oC) 30 phút.
8. Li tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch phía trên, thu lấy cặn DNA
tổng số.
9. Rửa cặn bằng Ethanol 70% hai lần (mỗi lần 0.7 – 1 mL)
10. Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp tube, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
(nơi sạch).
11. Hòa cặn trong 50 μL nước cất 2 lần vô trùng hoặc đệm TE và bảo quản dich DNA
ở -20 oC
4. Thực hiện phản ứng PCR
Chuẩn bị

Chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm RT-PCR.
Chuẩn bị
1. Pha đệm điện di TAE 1X
2. Chuẩn bị bản gel 1%: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100 mL TAE 1x vào
lọ. Cho lọ vào lò vi sóng để hoà tan agarose. Sau khi agarose đã tan hoàn toàn, bổ
sung 1 μL Ethidium Bromide, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng tới nhiệt độ khoảng 60
oC.
3. Dán băng dính xung quanh khay gel và đặt lựơc. Đổ gel vào khuôn (dày khỏang 1
cm). Để khuôn ở nhiệt độ phòng 30 phút để đông gel.
4. Lấy các tube PCR
5. Cho vào mỗi tube 5 μL đệm cài gel (Loading Dye x6, trộn đều và spin trong 5 giây.
Chạy điện di và kiểm tra kết quả
1. Sau 30 phút để khuôn ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chính giữa lược,
rút đều tay để không vỡ giếng), bỏ băng dính ở xung quanh khuôn gel.
3
2. Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 1x phủ ngập gel (gel
ngập sâu khoảng 1mm).
3. Nhỏ 15 μL mẫu PCR vào giếng Ngoài các mẫu PCR, luôn phải nhỏ thêm 1 giếng
DNA marker làm chuẩn.
4. Cắm nguồn điện cho máy điện di, đặt điện thế 100V và thời gian 30 phút.
5. Sau 30 phút, tắt máy điện di, đặt bản agarose lên máy phát tia cực tím và quan sát kết
quả. Sản phẩm PCR với cặp mồi BegoA For1/BegoARev1 sẽ có kích thước ~1.2 kb
6. Chụp ảnh
4
Bài 2. ELISA kiểm tra PRSV
1. Giới thiệu
Pappaya ringspot virus (PRSV) là virus RNA, thuộc chi Potyvirus. Virus gây bệnh đốm
hình nhẫn trên đu đủ và khảm lá trên nhiều cây hạ bầu bí
Kỹ thuật kiểm tra PRSV là PTA-indirect ELISA dùng kháng huyết thanh thô
2. Vật liệu và chuẩn bị

virus.
3. Cố định kháng thể thứ cấp liên kết enzyme (đặc hiệu kháng thể thỏ) vào bản
ELISA: Hoà kháng thể thứ cấp liên kết enzyme trong đệm PBS-T-P-O. Dùng pipet
cho 100 µL dịch kháng thể thứ cấp liên kết vào giếng ELISA và ủ bản ELISA ở 37
O
C 2-4 giờ trong hộp ẩm. Sau khi ủ, rửa bản ELISA như ở bước 1 và 2 lần bằng nước
cất. Ở bước này, kháng thể thứ cấp sẽ liên kết với kháng thể thỏ.
4. Cố định chất nền vào bản ELISA và đánh giá kết quả: Hòa 1 viên chất nền với 10
mL đệm chất nền. Dùng pipet cho 100 µL dịch chất nền vào giếng ELISA và ủ bản
ELISA ở nhiệt độ phòng trong hộp ẩm. Hộp cần phải để trong tối để giảm tốc độ tự
phản ứng của chất nền. Quan sát phản ứng sau 30 phút, 60 phút, 90 phút. Các giếng
xuất hiện màu vàng là các giếng chỉ thị mẫu nhiễm virus. Màu của phản ứng có thể
được lượng hóa bằng máy đọc ELISA, đo ở bước sóng 405 nm.
5
Đệm dùng trong PTA-ELISA
Đệm chiết mẫu = đệm carbonate (pH 9.6)
• 1.59 g sodium carbonate (Na2CO3)
• 2.93 g sodium bicarbonate (NaHCO3)
• 0.20 g sodium azide (NaN3)
• Hòa trong 900 ml H2O, điều chỉnh pH = 9.6 với HCl và lên thể tích 1 L.
Đệm PBS (pH 7.4) phosphate buffer saline
• 8.0 g sodium chloride (NaCl)
• 0.2 g monobasic potassium phosphate (KH2PO4)
• 1.15 g dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)
• 0.2 g potassium chloride (KCl)
• 0.2 g sodium azide (NaN3)
• Hòa tron 900 ml H2O, điều chỉnh pH = 7.4 với HCl hoặc NaOH và lên thể tích 1 L

Đệm rửa (đệm PBS-Tween (PBST))
• PBS + 0.5 ml Tween 20 trên lít