_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
MỤC LỤC
I/ MỤC LỤC trang 1
II/ ĐẶT VẤN ĐỀ trang 2
III/ DANH MỤC MỘT SỐ TỪ NGỮ VIẾT TẮT trang 2
IV/ NỘI DUNG trang 3
A . PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ trang 3
1/ Kháng nguyên: Đònh nghóa – Tính đặc hiệu – Tính sinh miễn dòch
2/ Kháng thể: Đònh nghóa – Phân loại .
3/ Nguyên tắc phản ứng kháng nguyên – kháng thể.
B . KỸ THUẬT ĐỊNH LƯNG trang 6
1/ Kỹ thuật cạnh tranh
2/ Kỹ thuật không cạnh tranh
C . CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG trang 8
1/ Miễn dòch ngưng kết (agglutination) trang 9
2/ Miễn dòch kết tủa (precipitation) trang 10
3/ Miễn dòch men (ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay) trang 11
4/ Miễn dòch vi hạt (MEIA: micro-partide enzyme immuno assay) trang 13
5/ Miễn dòch huỳnh quang (FIA: fluoro immuno assay) trang 14
6/ Miễn dòch phóng xạ (RIA: radio immuno assay) trang 15
7/ Miễn dòch hóa phát quang (chemiluminescense immuno assay) trang 16
 Hóa phát quang trực tiếp (DCLIA: direct-chemiluminescense immuno assay)
 Điện hóa phát quang (ECLIA: electro-chemilumminescense immuno assay)
V/ MỘT SỐ XN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP MD ĐỊNH LƯNG trang 18
VI/ KẾT LUẬN trang 19
VII/ TÀI LIỆU THAM KHẢO trang 19
1
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, có nhiều kỹ thuật đònh
lượng miễn dòch mới được nghiên cứu và ứng dụng vào việc chẩn đoán và

αc
αa
αb
Hình 01 : Một KN với nhiều loại epitope sẽ tạo
được nhiều MD đặc hiệu
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
3. Điều kiện để sinh miễn dòch của kháng nguyên :
 Trọng lượng phân tử (MW: Molecolar Weight): Trọng lượng phân tử tối
thiểu là khoảng 10.000 Dalton.Trọng lượng phân tử càng lớn tính sinh
MD càng mạnh.
 Cấu trúc phân tử: Cấu trúc phân tử càng phức tạp, tính sinh MD càng
mạnh. Xếp theo tính sinh MD từ mạnh đến yếu: mạnh nhất là protein; đến
các KN có protein như gluco-protein, lipo-protein, nucleo-protein; kém
nhất là polysaccharide. Lipid, AND, ARN không sinh MD.
 Tính lạ đối với cơ thể: một KN muốn sinh MD thì ít nhất KN đó phải mang
một epitope lạ đối với cơ thể.
II . KHÁNG THỂ
Kháng thể có bản chất hóa học là globulin, nên còn gọi là các
globulin miễn dòch (Ig). Cấu trúc cơ bản của KT gồm hai chuỗi nặng H
(heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain), có trọng lượng phân tử là
50.000 và 25.000, nối với nhau bằng cầu nối di-sulfur. KT có hai đầu, một
đầu gọi là Fab kết hợp đặc hiệu với một epitope KN, một đầu gọi là Fc , là
thành phần có thể tinh hóa được.
Về tính sinh KN, chuỗi L mang
KN kappa (k), hoặc lamda (λ), nghóa
là trên một phân tử KT chuỗi L chỉ có
thể là kappa hoặc lamda, chứ không
thể vừa là kappa vừa là lam da.
Chuỗi H thì tùy loại KT mà có thể là
γ , µ , α , δ , ε

125
, Co
63
…
 Các thuốc nhuộm huỳnh quang như: Fluorescein isothiocyanat (xanh
lục), rodamin (đỏ gạch)…
 Các enzym như peroxydaza, glucoza-oxydaza…
5
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
B . KỸ THUẬT ĐỊNH LƯNG
I/ Đối với các KN hữu hình (phản ứng ngưng kết): chủ yếu là bán
đònh lượng bằng cách pha loãng theo tuần tự
II/ Đối với hệ thống kháng nguyên-kháng thể hòa tan:
• Bằng cách đo độ đục của phức hợp KN-KT
• Bằng kỹ thuật “cạnh tranh” và “không cạnh tranh”
1.Kỹ thuật cạnh tranh
a)Nguyên tắc : KN không đánh dấu cạnh tranh với KN có đánh dấu, kết
hợp với KT.
b)Phản ứng có hai giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: Trong một dãy ống cho vào các thành phần:
 KN đã đánh dấu với lượng bằng nhau
 KN không đánh dấu với lượng tăng dần
 KT kháng KN với lượng bằng nhau
+ Giai doạn 2: Tách phần KN (gồm KN đánh dấu và KN không đánh dấu) đã
gắn KT và KN chưa gắn KT.
 Đo hoạt tính phóng xạ của phần KN đã gắn KT (B)
 Đo hoạt tính phóng xạ của phần KN chưa gắn KT (F)
 Xác lập tỉ số B/F và vẽ đồ thò chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa các tỉ
số này với nồng độ của KN không đánh dấu cho vào mỗi ống.
 Tỉ số B/F tỉ lệ nghòch với nồng độ KN không đánh dấu.

rãi nhất hiện nay.
4.Miễn dòch vi hạt: (MEIA: micro-particle enzyme immuno assay):
phương pháp cải tiến dựa trên ELISA.
5.Miễn dòch huỳnh quang (FIA: fluoro immuno assay): Dựa trên nguyên
tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (đònh lượng ) bằng chất đánh dấu là một
chất phát huỳnh quang. Phát hiện chất đo dựa trên môt quang kế huỳnh
quang (fluorometer).
6.Miễn dòch phóng xạ (RIA: radio immuno assay): Dựa trên nguyên tắc
kết hợp KN và KT và phát hiện (đònh lượng) bằng chất đánh dấu là một chất
phóng xạ (đồng vò phóng xạ của một nguyên tố như I
125
hay Co
63
).Phát hiện
chất đo dựa trên một máy đếm phóng xạ (Geiger meter)
7.Miễn dòch hóa phát quang (chemiluminescanse immuno assay): Dựa
trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (đònh lượng) bằng chất đánh
dấu là một chất phát quang ; phát hiện chất đo dụa trên một ống nhân quang
(luminometer). Ưu điểm của phương pháp này là có độ nhạy khát tốt, phản
ứng xảy ra nhanh (9-15 phút),dễ áp dụngtự động hóa xử lý hằng loạt.Dự trên
phương pháp kích hoạt phát quang, mhóm này được chia ra 2 nhóm phụ:
-Hóa phát quang trực tiếp (DCLIA: Direct-chemiluminescense immuno
assay) kích hoạt phát quang bằng cách thay đổi pH môi trường từ acide sang
kiềm.
-Điện hóa phát quang (ECLIA: Electro-chemiluminescense immuno
assay) kích hoạt phát quang bằng cách tạo điện áp trong dung dòch phản ứng.
8
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
I. Thử nghiệm ngưng kết hạt latex trên lam kính để đònh tính và bán đònh
lượng antistreptolysin O (ASO) trong HT (Latex agglutination slide test)

glycol, phản ứng xảy ra khi trộn đều với mẫu thử và ủ 10-20 phút ở nhiệt độ
PTN hay 37
o
C, và đo độ hấp thu quang ở bước sóng 334,340 hay 365 nm.
Đường cong chuẩn được xác lập bằng cách đo 5-7 nồng độ chuẩn.
Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, chỉ cần trang bò máy quang
phổ kế đo được bước sóng 340 nm và ủ nhiệt ở 37
o
C.
Khuyết điểm là chỉ hạn chế trong 1 số thử nghiệm cho phép mà thôi, và
độ nhạy của cơ chất phát hiện khá thấp.
10
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
III. ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay
Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (đònh lượng) bằng
chất đánh dấu là một enzyme, thường dùng alkaline phosphataze hoặc
peroxidaza
ELISA thuộc hệ thống kỹ thuật MD enzym pha rắn (giá đỡ KN hay KT).
Pha rắn là điều kiện cần thiết cho thành công của phản ứng, trên đó phản
ứng MD được xảy ra. Tùy theo yêu cầu kỹ thuật pha rắn có thể là:
Bề mặt polystyrol, polyvinylchlorid, các chất dẽo… Các thành phần phản
ứng được hấp phụ vật lý.
Cellulose, agarose… Các thành phần phản ứng được gắn bởi các liên kết
hóa học.
11
Máy đo quang
Máy ủ
Máy rửa
Kháng IgM
Kháng

thao tác thủ công, và sai số do ủ và rửa. Khuyết điểm: giá thành cao, phụ
thuộc vào nhà cung cấp.
12
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
IV.Miễn dòch vi hạt : MEIA : micro-particle enzyme immuno assay
Cải tiến từ kỹ thuật ELISA: pha cứng (solid phase) của phản ứng (KN hay
KT) được gắn trên các vi hạt treo lơ lững trong dung dòch, đem đến các ưu
điểm sau :
Tăng diện tích tiếp xúc KN và KT, làm tăng độ nhạy, giảm thời gian ủ,
giảm thời gian làm phản ưng
Giúp tự động hóa kỹ thuật rửa, giúp rửa sạch hơn
13
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
V. Miễn dòch huỳnh quang (FIA: fluoro immuno assay)
Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA,
ngoại trừ 2 điểm sau:
Thay thế chất đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang.
Phát hiện (đònh lượng) chất đo bằng một quang kế huỳnh quang
(fluorometer)
Khuyết điểm cơ bản nhất là vấn đề nhiễu: chất phát huỳnh quang có thể
hiện diện trong tự nhiên. Do đó tín hiệu huỳnh quang phát ra phải cao hơn hẳn
so với nhiễu, nên độ nhạy của thử nghiệm này không cao.
14
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
VI. Miễn dòch phóng xạ (RIA: radio immuno assay)
Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA,
ngoại trừ 2 điểm sau:
Chất đánh dấu là một đồng vò phóng xạ của một nguyên tố như I
125
hay

sau đó được gán vào chất liên
kết kháng thể mang acridium
PP gắn cạnh tranh
KN cần đo và chất đánh dấu
mang acridinium gắn cạnh
tranh vào KT trên pha rắn
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
(Alkaline phosphatase có trọng lượng 68.000) gia tăng khả năng thâm nhập
vào cơ chất và giảm thiểu hiệu ứng che lấp vò trí gắn kết (binding site) KN-KT.
VIII.Miễn dòch Điện hóa phát quang (ECLIA: Electro-
chemiluminescense immuno assay)
Dựa trên sự sử dụng phức hợp Ruthemium (II) tris (bipyridyl) complex
[Ru(bry)
3
2+
] và Tripropylamine TPA (Hoạt động có sự khởi động điện). Phản
ứng xảy ra dưới tác dụng của điện áp.
17
e
-
Điện cực
e
-
TPA
TPA
**
TPA
*
[Ru(bpy)
3

4
, CRP, Ferritin
IgA, IgG, IgM, Microalbumin…
Miễn dòch men (ELISA, MEIA)
Các hệ thống ELISA thủ công
và bán tự động
Abbott (AxSYM)
BioMerrieux (Vidas, MiniVidas)
• Các hormon : TSH, LH, FSH,
Prolactin, FT3, FT4, TBG,
Thyroglobulin, Insulin, Testosteron,
Progesteron…
Miễn dòch huỳnh quang
Abbott (iMX, AxSYM)
Hóa phát quang trực tiếp
Abbott (Architect i2000 )
Bayer (ACS:180SE, ADVIA centaur)
Điện hóa phát quang
Roche (Elecsis 1010, Elecsis 2010)
18
_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng
KẾT LUẬN
Các kỹ thuật miễn dòch đònh lượng ngày càng được nghiên cứu và áp
dụng vào việc chẩn đoán và điều trò trên cơ sở theo dõi các cơ chế sinh lý
bệnh cũng như sự tiến triển của các giai đoạn bệnh lý.
Việc tìm ra các phương pháp để phát hiện dấu hiệu thay đổi bệnh lý
của các bệnh hiểm nghèo (tiểu đường, nhồi máu cơ tim, ung thư, viêm gam
siêu vi, AIDS…) càng chính xác và nhanh chóng giúp cho các thầy thuốc có
hướng chẩn đoán và điều trò kòp thời và hiệu quả hơn cho bệnh nhân.
Tuy nhiên việc chuẩn hóa các phương pháp và tập trung hóa các trung