1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
&
Công nghệ proteins- enzyme
Chuyên đề 7:
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC
NĂNG CỦA PROTEIN
GVHD: TS. Đặng Xuân Nghiêm
Sinh viên thực hiện: Triệu Thị Linh
Mã SV: 550362
Hà nội, 4/2013
1
2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN
PHẦN 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN
1. Khái Niệm
1.1Protein
1.1.1 Protein là gì?
Tất cả các tế bào sống đều chứa Protein, điều đó có nghĩa là protein là chất cần cho
sự sống. Vì người ta cho rằng Protein là thành phần quan trọng nhất trong các vật
chất của sự sống, cho nên trong tiếng anh, protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa
là “thứ nhất”. Về định nghĩa chính xác Protein là gì, có nhiều cách nói khác nhau,
nhưng tự chung lại, đều thống nhất cho rằng: Protein là hợp chất cao phân tử giữ
nhiều vai trò nòng cốt trong cơ thể. Hầu hết chúng làm việc trong tế bào đáp ứng yêu
cầu của các bào quan và mô trong cơ thể về cấu trúc, chức năng và điều hòa. Protein
được chứa trong tất cả các phần của cơ thể của bạn, làn da, cơ bắp, tóc, máu, bộ
phận cơ thể, đôi mắt, ngay cả móng tay và xương
.
1.1.2 Cấu trúc – chức năng của Protein
Theo công trình nghiên cứu :” What is protein” của Georgia C. Lauritzen thuộc đại

trong DNA.
3
4
Vídụ hình bên:
Phenylalanine
hydroxylase.
• Thông tin -
Messenger
protein thông tin, như
một số loại hormone,
truyền tải tín hiệu để
phối hợp các quá trình
sinh học giữa các tế bào,
mô, cơ quan khác nhau.
Ví dụ: hormone tăng
trưởng (Growth
hormone)
• Thành phần cấu
trúc
4
5
Những protein này cung cấp cấu trúc và nuôi dưỡng tế bào. Trong một phạm vi lớn
hơn, chúng còn cho phép tế bào di chuyển. Ví dụ: Actin
• Vận chuyển-dự
trữ
các protein này bám
vào những nguyên tử
và phân tử nhỏ bên
trong tế bào và lưu
thông trong cơ thể. Ví

máu, giảm khả năng miễn dịch sinh học của cơ thể và tăng tính cảm thụ
của cơ thể với các bệnh nhiễm khuẩn.
6
7
2. Phân tích cấu trúc Protein
2.1 Phân tích cấu trúc Protein là gì?
Như đã trình bày, mỗi một loại protein với chức năng khác nhau sẽ có một thành
phần và trình tự axit amin khác nhau, cũng như cấu trúc không gian khác nhau.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra những thông tin này là vô cùng cần thiết trong
sinh học. Từ các thông tin đó, chúng ta có thể biết được chính xác protein nào, có
chức năng gì, để từ tìm cách tổng hợp nhân tạo protein, hay bố sung protein cần
hoặc loại bỏ các protein có hại. Phân tích cấu trúc Protein chính là nhằm mục đích
này.
Hiện nay, trên thế giới, công tác nghiên cứu về phân tích cấu trúc protein đang rất
được đẩy mạnh. Hàng loạt các công trình nghiên cứu, các bài báo khoa học được
công bố cho phép con người có cái nhìn sâu và rộng hơn về thế giới sinh học phân tử
protein. Và chúng cũng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực: y tế, nông nghiệp,
…
2.2 Các phương pháp phân tích
Protein, tuy được gọi là một “đại” phân tử của thế giới vi mô, tuy nhiên mắt thường
của chúng ta sẽ không thể nhìn thấy chúng được. Chính vì vậy, để nghiên cứu những
đối tượng này, cần sử dung những phương pháp đặc hiệu với sự trợ giúp của các
phương tiện khoa học kỹ thuật hiện đại, đó cũng chính là lý do việc phân tích cấu
trúc protein chỉ thực sự khởi sắc trong vài năm trở lại đây, theo sự tiến bộ của khoa
học kỹ thuật.
7
8
Hiện nay, có nhiều phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu protein, sau đây xin
giới thiệu sơ lược một vài phương pháp hữu hiệu nhất
2.2.1 Tinh thể học tia X (X-ray crystallography)

Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một kỹ thuật quang phổ được sử dụng rộng rãi. Sự
đa dạng tuyệt vời của quang phổ cho phép xác định cấu trúc ba chiều của các
protein. Phần dưới sẽ cung cấp một cái nhìn tổng quan về các khái niệm lý thuyết trong
phương pháp NMR cũng như giới thiệu các bước xác định cấu trúc của một protein
bằng phương pháp này
3. Nghiên cứu về chức năng của protein
3.1. Hệ protein học (proteomics)
Việc phát triển của các kỹ thuật giải mã trình tự ADN, kết hợp với các phương pháp
tách chiết, tinh sạch và phân tích trình tự protein đã mở đường cho sự hình thành một
chuyên ngành mới gọi là hệ protein học. Proteomics là chuyên ngành nghiên cứu về
toàn bộ tập hợp protein được một mô, tế bào hoặc cơ thể tạo ra trong các điều kiện đặc
thù, phân tích mức độ phổ biến của từng protein và sự tương tác của chúng với nhau và
với các phân tử khác (ví dụ như ADN) trong quá trình hoạt động của tế bào. Nếu như
các kỹ thuật phân tích vi dãy phản ứng (microarray) có thể giúp nhận biết được sự biểu
hiện của các gen trên cở sở phân tích hệ gen, thì các kỹ thuật proteomics cho phép xác
định được hình ảnh tổng thể về toàn bộ vốn protein của một tế bào, mô hoặc cơ thể.Hệ
protein học được dựa trên ba phương pháp cơ bản: điện di hai chiều trên gel
polyacrylamid để tiến hành phân tách các protein, khối phổ để xác định khối lượng
phân tử và định tính protein (hoặc các đoạn peptit từ phân tử protein đó), và tin sinh học
9
10
để đối chiếu các phân tử protein và các đoạn peptit với các trình tự mã hóa của chúng
trong hệ gen. Một tế bào riêng lẻ thường ít nhất tạo ra hàng nghìn loại protein khác
nhau, trong khi việc sử dụng đơn lẻ phương pháp điện di truyền thống trên gel
polyacrylamid thường không đủ để phân lập và tách biệt các protein này. Vì vậy, như
tên gọi của nó, phương pháp điện di hai chiều cho phép phân tách các phân tử protein
trên gel điện di theo hai chiều được thực hiện kế tiếp nhau.
Trong bước thứ nhất, các phân tử protein được phân đoạn dựa trên điểm đẳng điện của
chúng (theo nguyên tắc hội tụ đẳng điện). Theo nguyên tắc này, khi một gradient pH
được tạo ra từ đầu này đến đầu kia của bản điện di, thì tại vị trí pH tương ứng làm trung

protein. Sau khi được nạp vào một mẫu tốt của một loại gel polyacrylamide, các
protein di chuyển đi từ cực âm và về phía cực dương. Khả năng sàng lọc của gel cho
phép các protein nhỏ hơn để di chuyển nhanh hơn so với lớn hơn. Quãng đường đi
trong một thời gian nhất định là tỷ lệ thuận với khối lượng của các phân tử.
Điện di gel polyacrylamine hai chiều
11
12
Các protein được tách ra nhờ đi qua một ống gel polyacrylamine theo gradient nồng
độ pH từ 3 đến 10, nó di chuyển đến khi bị vô hiệu hóa, sau đó lấy ống gel ra và xử
lí bằng SDS, các protein được tách theo kích thước, và chúng di chuyển từ âm sang
dương, mảnh nào có khối lượng nhỏ, chạy xa hơn những protein có khối lượng lớn
Tóm lại phương pháp điện di gel polyacrylamine dùng để phân tách các protein có
khối lượng khác nhau.
3.2.phương pháp khối phổ
3.2.1. phương pháp khối phổ kế tiếp
Phương pháp khối phổ kế tiếp (MS/MS) có thể được dùng để xác định các vùng
trình tự protein khác nhau. Khối phổ là phương pháp xác định chính xác khối lượng
của các các phân tử nhỏ. Một cách vắn tắt phương pháp này được mô tả như sau:
phân tử cần phân tích được cho bay qua một thiết bị (trong điều kiện chân không)
trong điều kiện tốc độ di chuyển của nó tương quan với tỉ số khối lượng / điện tích.
Trên cơ sở này người ta có thể đo được thời gian bay của phân tử và xác định được
12
13
khối lượng của nó. Đối với các phân tử sinh học có kích thước nhỏ như các chuỗi
peptit và các phân tử protein nhỏ, thì trọng lượng phân tử của nó có thể xác định
chính xác đến từng Dalton.
Để xác định khối lượng phân tử protein bằng phương pháp MS /MS, trước tiên
phân tử protein thường được cắt thành các đoạn peptit có trình tự ngắn (thường dưới
20 axit amin) nhờ sử dụng enzym đặc hiệu, chẳng hạn như trypsin. Hỗn hợp các
đoạn peptit này sau đó được đưa vào phân tích khối phổ và chúng phân tách nhau ra

Xác định các chuỗi peptide của một peptide ngắn là dễ dàng đạt được bằng cách sử
dụng các kỹ thuật quang phổ khối lượng hiện tại. Xác định trình tự toàn bộ của một
protein là quá phức tạp vào thời điểm này, nhưng một ngày nào đó có thể là khả thi.
Để xác định trình tự, một mẫu protein tinh khiết phải được lấy hoặc cắt một vị trí từ
một loại gel hai chiều hoặc bằng cách thanh lọc HPLC. Protein này sau đó được
phân hủy thành những mảnh bằng cách sử dụng một protease như trypsin, mà cắt
protein ở phía bên đầu cuối của carboxy-arginine và lysine. Cắt một protein thành
các peptide giúp làm giảm các đặc tính không mong muốn của toàn bộ protein Ví
dụ, các protein màng tế bào kỵ nước và dính lại với nhau, và phân giả thành các
mảnh peptide phá hủy đặc tính này. Vấn đề tính hòa tan có thể cũng thường được
giải quyết bằng cách tiêu hóa một protein thành các peptide. Xác định trình tự của
các peptide sẽ mang lại trình tự của protein ban đầu.
Phương pháp phổ biến nhất xác định các chuỗi peptide bắt đầu bằng cách tách các
peptide bằng cách sử dụng một cột HPLC gắn trực tiếp vào máy quang phổ khối
lượng. Cột là một ống mao dẫn siêu nhỏ để giữ thể tích mẫu càng nhỏ càng tốt. Pha
động một dung môi hữu cơ tách các peptide theo thứ tự kỵ nước của chúng. Từ ống
ống mao dẫn HPLC, các mẫu nhập vào buồng khối phổ kế. Mỗi peptid được ion hóa
thành nhiều mảnh. Đối với các peptide, các ion thông thường bao gồm một hình thức
nhân đôi proton hóa (M+2H)+2 , M là khối lượng của peptide và H + là khối lượng
của proton. Các đỉnh ion được vẽ so với khối lượng để tính tỷ lệ hoặc m / z. Đối với
15
16
các ion peptide nhân đôi proton hóa, điều này sẽ là khối lượng của ion chia cho 2. Ví
dụ, nếu các peptide ban đầu là 1232,55 dalton, ion proton hóa đôi sẽ có một khối
lượng của 1232,55 dalton + (2 × 1,0073) cho lượng hydro bổ sung . đỉnh cao sẽ xuất
hiện tại 617,2828.
(Lưu ý: khối lượng để tính tỷ lệ là nơi đỉnh cao được vẽ, có nghĩa là, khối lượng cho
ion này là 1234,5646 và phí là +2 đỉnh xuất hiện tại m / z hoặc 1234,5646 / 2. Khi
phổ kế khối tách ion peptide, bước đầu tiên là để xác định trạng thái điện tích ion.
Thường là một cụm các đỉnh xảy ra cho mỗi ion peptide

HPLC, các mẫu nhập vào buồng khối phổ kế. Mỗi peptid được ion hóa thành nhiều
mảnh.
Đối với các peptide, các ion thông thường bao gồm một hình thức nhân đôi proton hóa
(M+2H)+2 , M là khối lượng của peptide và H + là khối lượng của proton. Các đỉnh ion
được vẽ so với khối lượng để tính tỷ lệ hoặc m / z. Đối với các ion peptide nhân đôi
proton hóa, điều này sẽ là khối lượng của ion chia cho 2. Ví dụ, nếu các peptide ban đầu
là 1232,55 dalton, ion proton hóa đôi sẽ có một khối lượng của 1232,55 dalton + (2×
1,0073) cho lượng hydro bổ sung . đỉnh cao sẽ xuất hiện tại 617,2828. (Lưu ý: khối
lượng để tính tỷ lệ là nơi đỉnh cao được vẽ, có nghĩa là, khối lượng cho ion này là
1234,5646 và phí là +2 đỉnh xuất hiện tại m / z hoặc 1234,5646 / 2. Khi phổ kế khối
tách ion peptide, bước đầu tiên là để xác định trạng thái điện tích ion. Thường là một
cụm các đỉnh xảy ra cho mỗi ion peptide.Nếu đỉnh là 1 dalton thì trạng thái tích điện
của peptide là 1. Nếu đỉnh là 0,5 dalton thì trạng thái tích điện là 2.Để xác định trình tự
peptide, hai vòng của khối phổ được sử dụng Này được gọi là cùng khối phổ bởi vì ion
là một trong những sản xuất trong vòng đầu tiên của khối phổ. sau đó ion được phân
mảnh bởi va chạm với một khí như hydro, argon, hoặc heli. Như trước đây, các mảnh
vỡ ion được phân cách dựa vào khối lượng của chúng để tính tỷ lệ. Mỗi đỉnh thường
thay đổi bởi một amino axit, và sự khác biệt kích thước giữa các đỉnh núi xác định.
chuỗi axit amin.Đôi khi quang phổ thu được cho một ion peptide là mơ hồ, cơ sở dữ
liệu như vậy của quang phổ ion peptide được sử dụng để so sánh.
4.2.4. Định lượng protein bằng phương pháp khối phổ
Khối phổ có thể dùng để định lượng một lượng peptide cụ thể từ một lượng protein, mà
có tương quan trực tiếp với protein đó ( hình 9.14). để so sánh các số liệu tương đối của
protein thì ta phải tiến hành thí nghiệm các mẫu trong điều kiện khác nhau.
 Mẫu 1 trong điều kiện acid amin gắn đồng vị nặng Các đồng vị nặng thường là
deuterium, 2 H, nhưng cũng có thể là 13 C hoặc 15 N
 Mẫu 2 là các tế bào nuôi trong điều kiện bình thường
 Hai mẫu được trộn lẫn và phân tích bằng sắc ký lỏng ghép với khối lượng ESI
19
20

22
Là kĩ thuật sinh học phân tử được dùng để khám phá các tương tác protein-
protein, và tương tác protein-DNA bằng cách kiểm tra tương tác vật lý giữa hai
protein hoặc một loại protein duy nhất và một phân tử DNA tương ứng
Đi tiên phong bởi Stanley Fields và Song vào năm 1989, kỹ thuật này đã được
thiết kế để phát hiện các tương tác protein-protein bằng cách sử dụng GAL4
phiên mã kích hoạt của nấm men Saccharomyces cerevisiae . Protein GAL4 kích
hoạt một loại protein liên quan trong việc sử dụng galactose, hình thành cơ sở lựa
chọn. Kể từ đó, cùng một nguyên tắc đã được điều chỉnh để mô tả nhiều phương
pháp thay thế bao gồm phát hiện tương tác protein-DNA, DNA-DNA và sử dụng
Escherichia coli thay vì nấm men
Ứng dụng:
22
23
 Xác định trình tự rất quan trọng cho sự tương tác
 Xác định chức năng của protein
Sự gắn kết của một kích hoạt phiên mã protein GAL4 để vùng promoter của gen
reporter kích hoạt phiên mã và dịch mã. DNA liên kết(DBD) với các yếu tố promoter
RNA polymerase, nơi nó kích hoạt phiên mã. Trong hệ thống hai-lai, các protein khác
nhau được tạo ra bằng cách lai gen mồi là DBD hợp nhất về mặt di truyền với
protein mục tiêu và mồi AD hợp nhất với protein đang được sàng lọc để tương tác với
mồi. Khi các DBD và AD liên kết với nhau thì chúng sẽ kích hoạt phiên mã của gen
reporter. Có hai vectơ là cần thiết để thực hiện phân tích hai-lai
Vector đầu tiên có một hoặc nhiều nguồn nhân bản cho các protein mồi 3 'của GAL4-
DBD. Vector thứ hai có một nguồn nhân bản cho protein Prey 5 'của GAL4-AD . Cả hai
plasmid phải được thể hiện trong cùng một tế bào nấm men. Các gen reporter phải được
thiết kế dưới sự kiểm soát của các trình tự nhận biết GAL4.Gen reporter thông thường
bao gồm HIS3 mã hóa cho một enzyme trong con đường histidine hoặc URA3.
Nguyên tắc Hai Lai
Phân tích (A) các yếu tố phiên mã men có 2 yếu tố: các DBD (màu tím) công nhận các

Định tính protein dựa trên phương pháp thẩm tách miễn dịch (immunoblotting)
Mặc dù có bản chất khác ADN và ARN, việc xác định sự có mặt của một loại
protein trong số các protein có trong mẫu sinh học theo nguyên tắc gần giống với
các phương pháp thẩm tách (còn gọi là lai) Southern và Northern (tương ứng với
trường hợp của ADN và ARN). Tuy vậy, đối với protein, phương này định tính
này dựa trên dựa trên nguyên tắc miễn dịch đặc thù của protein nên còn được gọi
là phương pháp thẩm tách miễn dịch (immunoblotting) hay phương pháp thẩm
tách (lai) Western. Trong phương pháp thẩm tách miễn dịch, các phân tử protein
sau khi được phân tách trên điện di được chuyển và gắn lên màng. Màng này sau
đó được ủ trong một dung dịch chứa kháng thể đặc hiệu với loại protein tinh sạch
được quan tâm nghiên cứu. Kháng thể sẽ tìm thấy loại protein tương ứng ở trên
màng lọc và gắn vào. Cuối cùng, bằng việc sử dụng phản ứng enzym hiện màu,
người ta có thể quan sát được vị trí kháng thể liên kết trên màng. Như vậy, tất cả
các phương pháp lai Southern, Northern và Western đều có điểm chung là sử
dụng các hợp chất chọn lọc để quan sát sự có mặt của một hoặc một số loại phân
tử đặc thù trong các hỗn hợp phức tạp.
5. Protein array
Giống như phương pháp ELISA, phương pháp này sử dụng kháng thể với các protein
khác nhau gắn vào bề mặt vật rắn. các mẫu thử nghiệm được phân lập và đánh dấu bằng
huỳnh quang.
Tiến hành trong hai điều kiện:
 Mẫu 1 dán nhãn với Cy3, phát huỳnh quang màu xanh lá cây
 Mẫu 2 dán nhãn với Cy5, phát huỳnh quang màu đỏ
25