BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI HỢP TÁC KH&CN
VIỆT NAM-CỘNG HÒA PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ
LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÂN HÓA CỦA RỄ LÚA
BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY SIÊU BIỂU HIỆN VÀ BẤT
HOẠT RNA (RNA INTERFERENCE) Chủ nhiệm đề tài: TS. LÊ QUỲNH MAI
TS. Lê Quỳnh Mai PGS. TS. Lê Huy Hàm

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ
(ký tên) (ký tên và ñóng dấu khi gửi lưu trữ)
Hà Nội – 2009 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP
__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ðộc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng năm 200 BÁO CÁO THỐNG KÊ

E-mail: [email protected]
Website:
ðịa chỉ: Km2, Phạm Văn ðồng, Từ liêm, Cầu giấy, Hà Nội.
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS. TS. Lê Huy Hàm
Số tài khoản: 301.01.035.4
Ngân hàng: Kho bạc nhà nước Từ Liêm, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản ñề tài: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
4. Chủ nhiệm ñề tài ñối tác nước ngoài
Họ và tên: Pascal Gantet
Học hàm, học vị, chuyên môn: Giáo sư
Chức danh khoa học: Giáo sư trường ðH Montppellier 2, Pháp
ðiện thoại cơ quan: +33 (0) 67 61 65 44
Fax: 33 (0) 67 61 56 05
E-mail:
[email protected]

II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1. Thời gian thực hiện ñề tài/dự án:
- Theo Hợp ñồng ñã ký kết: từ tháng 01/ năm 2008 ñến tháng 12/ năm 2009.
- Thực tế thực hiện: từ tháng 01/năm 2008 ñến tháng 12/năm 2009.

2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1.250 tr.ñ, trong ñó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH:1.250 tr.ñ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.ñ.
+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi ñối với dự án (nếu có): …………

b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Theo kế hoạch Thực tế ñạt ñược

Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Trả công lao ñộng
(khoa học, phổ
thông)
350 350 0 315,56 315,56 0
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
500 500 0 497,825

497,825

0
3 Thiết bị, máy móc
4 Xây dựng, sửa chữa
nhỏ

5 ðoàn ra 202 202 0 201,912

201,912

0
6 ðoàn vào 64 64 0 46,5 46,5 0
7 Chi khác 134 134 0 99,879 99,879

Tổng cộng
1.250 1.250 0 1.146,1 1.146,1 0
- Lý do thay ñổi (nếu có):


Tổng cộng
- Lý do thay ñổi (nếu có):

3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện ñề tài/dự án:
(Liệt kê các quyết ñịnh, văn bản của cơ quan quản lý từ công ñoạn xác ñịnh nhiệm vụ, xét
chọn, phê duyệt kinh phí, hợp ñồng, ñiều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện
nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì ñề tài, dự án (ñơn, kiến nghị ñiều chỉnh nếu có)
Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản Ghi chú
1 Quyết ñịnh số 355/Qð-
BKHCN
Ngày 10 tháng 3 năm
2008.
Về việc phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác quốc tế
về khoa học và công nghệ theo nghị ñịnh thư bắt
ñầu thực hiện từ năm 2008

2 Quyết ñinh số
3152/Qð-BKHCN
Ngày 27 tháng 12 năm
2007
Về việc thành lập Tổ thấm ñịnh ñề tài khoa học
và công nghệ theo Nghị ñịnh thư.

3 Quyết ñinh số
2530/Qð-BKHCN

hiện
Nội dung
tham gia chủ
yếu
Sản phẩm
chủ yếu ñạt
ñược
Ghi chú*

1
2

- Lý do thay ñổi (nếu có):

5. Cá nhân tham gia thực hiện ñề tài, dự án:
(Người tham gia thực hiện ñề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không
quá 10 người kể cả chủ nhiệm)
Số
TT
Tên cá nhân ñăng
ký theo Thuyết
minh
Tên cá nhân ñã
tham gia thực hiện

Nội dung
tham gia
chính
Sản phẩm
chủ yếu ñạt


7
Nguyễn Văn Khiêm Nguyễn Văn Khiêm Nội dung 2 Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen

8
Nguyễn Thành ðức Nguyễn Thành ðức Nội dung 2 Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen

9
Pascal Gantet Pascal Gantet Nội dung 1 Các vector
chuyển gen

10
Jean-Christophe
Breitler
Jean-Christophe
Breitler
Nội dung 1 Các vector
chuyển gen

- Lý do thay ñổi ( nếu có):

6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số

2

- Lý do thay ñổi (nếu có):

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
ñịa ñiểm )
Thực tế ñạt ñược
(Nội dung, thời gian,
kinh phí, ñịa ñiểm )
Ghi chú*
1
2

- Lý do thay ñổi (nếu có):

8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, ñiều tra
khảo sát trong nước và nước ngoài)
Thời gian
(Bắt ñầu, kết thúc
- tháng … năm)
Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc ñánh giá chủ yếu)

5 Nội dung 2: Chọn lọc, phân
tích, ñánh giá các cây lúa
chuyển gen
2009 2009 Viện DTNN
- Lý do thay ñổi (nếu có):

III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ðỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH&CN ñã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
Số
TT
Tên sản phẩm và chỉ
tiêu chất lượng chủ
yếu
ðơn
vị ño
Số lượng
Theo kế
hoạch
Thực tế
ñạt ñược
1 Phương pháp thiết kế
vector mang gen
nghiên cứu
Phương
pháp
1 1 1
2 Phương pháp thiết kế
vector mang các
RNAi tương ứng của


Số
TT
Tên sản phẩm

Theo kế hoạch Thực tế
ñạt ñược
Ghi chú

1

- Lý do thay ñổi (nếu có):

c) Sản phẩm Dạng III:
Yêu cầu khoa học
cần ñạt

Số
TT
Tên sản phẩm

Theo
kế hoạch
Thực tế
ñạt ñược
Số lượng, nơi
công bố
(Tạp chí, nhà
xuất bản)
1 Bài báo quốc tế: Giang N. Khong,


ñ) Tình hình ñăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền ñối với giống cây
trồng:
Kết quả
Số
TT
Tên sản phẩm
ñăng ký
Theo
kế hoạch
Thực tế
ñạt ñược
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1

2
- Lý do thay ñổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ñã ñược ứng dụng vào thực tế
Số
TT
Tên kết quả
ñã ñược ứng dụng
Thời gian
ðịa ñiểm

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do ñề tài, dự án tạo ra so với các
sản phẩm cùng loại trên thị trường…)
- ðề tài có thể mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng mới ở nước ta.
- Cung cấp các dòng cây chuyển gen có triển vọng kháng hạn, giảm chi phí sản
xuất và thiệt hại mùa màng do hạn hoặc các nhân bất lợi khác.

3. Tình hình thực hiện chế ñộ báo cáo, kiểm tra của ñề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính,
người chủ trì…)
I Báo cáo ñịnh kỳ
Lần 1:
Nội dung 1: Nghiên cứu
tạo các cây lúa chuyển
gen siêu biểu hiện các
yếu tố phiên mã ở rễ lúa
và sử dụng kỹ thuật
RNAi gây bất hoạt các
gen này.

01/2008 –
12/2008
- ðã phân lập ñược RNA tổng số từ
mẫu rễ lúa xử lí kháng hạn và cây ñối

Nội dung 2: Chọn lọc,
phân tích, ñánh giá các
cây lúa chuyển gen

OsMADS26; OsMADS56.
- ðã thiết kế thành công vector
pC5300.OE mang gen nghiên cứu
OsMADS26.
- ðã xác ñịnh và tạo ñược 7 ñoạn
GST khác nhau từ các cDNA tương
ứng: OsNAC1; OsMADS26;
OsMADS25; OsMADS56
- ðã thiết kế thành công 2 vector gây
bất hoạt gen OsMADS26 mang 01
trong 02 trình tự ñích khác nhau
(GST1 và GST2) với vector gốc là
vector RNAi: pANDA.
- ðã xây dựng thành công mô hình
tái sinh cây lúa invitro phục vụ công
tác chuyển gen quan tâm.
- ðã xây dựng thành công quy trình
chuyển gen với các vector siêu biểu
hiện và bất hoạt gen OsMADS26
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
- ðã chọn lọc và ñánh giá các dòng
lúa chuyển gen siêu biểu hiện và bất
hoạt

II Kiểm tra ñịnh kỳ
Lần 1

ðã ủng hộ, tạo ñiều kiện thuận lợi về mọi mặt tài chính, hành chính, trang thiết
bị và nhân lực cho việc thực hiện và hoàn thành ñề tài trong thời gian quy ñịnh.

Hà Nội, Ngày tháng năm 2010
Chủ nhiệm ðề tài
TS. Lê Quỳnh Mai

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

1
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 4
DANH MỤC CÁC BẢNG 5
I. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11
1.1. Tầm quan trọng và các yếu tố ảnh hưởng ñến năng suất, sinh trưởng của
cây lúa 11
1.2. Nghiên cứu xác ñịnh hệ gen liên quan ñến khả năng kháng hạn ở cây trồng
15
1.3. Khám phá ra các gen “hàng ñầu” tham gia vào việc cải thiện khả năng
kháng hạn của thực vật thông qua các thành tựu chuyển gen 16
1.4. Vai trò của các yếu tố phiên mã trong việc ñiều khiển biểu hiện của gen
phản ứng với hạn 18
1.5. Biểu hiện của các yếu tố phiên mã phụ thuộc hàm lượng ABA nội bào
trong ñiều kiện hạn hán 19
1.6. Giới thiệu chung về ñối tác cùng nghiên cứu trong ñề tài 20
1.7. Mục tiêu của ñề tài 22

III. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46
3.1. Nghiên cứu tạo các cây lúa chuyển gen siêu biểu hiện các yếu tố phiên mã
ở rễ lúa và sử dụng kỹ thuật RNAi gây bất hoạt các gen nghiên cứu. 46
3.1.1. Xác ñịnh các gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc
và chức năng bộ rễ lúa 46
Bảng 3.1. Tên, trình tự các cặp mồi nhân gen Os06, Os08 và Os10 47
3.1.2. Nghiên cứu thiết kế các gen RNAi có khả năng gây bất hoạt các gen
của các yếu tố phiên mã nghiên cứu. 56
3.1.3. Chuyển các plasmid thu ñược vào các callus lúa thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefacien 62
3.2. Chọn lọc, phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen 71
3.2.1. Chọn lọc cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ kiểu hình 71
3.2.2. Chọn lọc cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ sinh lý 75
3.2.3. ðánh giá cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ kiểu hình 79
3.2.4. ðánh giá cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ sinh lý 83
3.3. Các kết quả ñạt ñược với sự hợp tác của trung tâm CIRAD, Pháp 87
3.3.1. Kiểm tra sự có mặt của gen OsMADS26 (ORF8) và số lượng copy
TDNA trong các dòng lúa biến nạp với vector PC5300.OE thế hệ T0 và T1
bằng Southern blot 87
3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của GST1 và GST2 và số lượng copy T-DNA
trong các dòng lúa biến nạp với vector gây bất hoạt gen pANDA thế hệ T0 và
T1 bằng Southern blot 90
3.3.3. Phân tích biểu hiện của gen OsMADS26 (ORF8) trong các dòng lúa
biến nạp với vector PC5300.OE hoặc pANDA bằng kỹ thuật northern blot 92
IV. CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT VÀ ðÁNH GIÁ KẾT QUẢ ðỀ TÀI 94
4.1. KẾT QUẢ KHOA HỌC 94

LB: Môi trường Luria-Bertani
ORF: Open reading frame
PCR: Polymerase Chain Reaction
pH: Potential Hydrogen
RNAi: Axít ribonucleic interference
RNase: ribonuclease
RT: Reverse transcription
SDS: sodium dodecyl sulfate
TAE: tris-acetate-EDTA
Taq: Thermus aquaticus polymerase
TE: Tris-EDTA
Tm: Nhiệt ñộ bắt cặp
UV: ultra-violet
v/p: vòng/phút

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

5
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Tên, trình tự các cặp mồi nhân gen Os06, Os08 và Os10 47
Bảng 3.2. Các ñoạn GST thuộc các gen yếu tố phiên mã khác nhau 59
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4-D (mg/l) ñến khả năng tạo mô sẹo từ hạt lúa
(giống Nipponbare) 62
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn hydrate carbon 63
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng ñộ agar 64
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển ñến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh64
Bảng 3.7. Kết quả tái sinh của giống nipponbare trên môi trường tối ưu 65

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

Hình 3.17. Hình thái rễ sau thay ñổi từ 2 ñến 7 ngày tuổi 71
Hình 3.18. Hình thái bộ rễ lúa ở các dòng chuyển gen khác nhau (7 ngày tuổi) 72
Hình 3.19. So sánh mật ñộ rễ của các dòng lúa chuyển gen 73
Hình 3.20. So sánh tính hướng trọng lực của các dòng lúa chuyển gen 74
Hình 3.21. ðiện di kiểm tra chất lượng RNA tách chiết trên gel Agarose 1% 75
Hình 3.22: Mức ñộ biểu hiện của gen OsMADS26 ở các bộ phận khác nhau của cây
lúa và trong ñiều kiện stress áp suất thẩm thấu và mặn. 76
Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

7
Hình 3.23. So sánh sự sinh trưởng của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu hiện
hoặc bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện ñối chứng (MS/2) và gây stress
áp suất thẩm thấu (MS/2 + 125 mM Manitol) 77
Hình 3.24. So sánh chiều cao thân của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu hiện
hoặc bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện ñối chứng (MS/2) và gây stress
áp suất thẩm thấu (MS/2 + 125 mM Manitol) 78
Hình 3.25. Tăng trưởng chiều cao cây của các dòng siêu biểu hiện gen 79
Hình 3.26. Tăng trưởng chiều cao cây của các dòng gât bất hoạt gen 80
Hình 3.27. Sự tăng trưởng chiều cao cây của các dòng bất hoạt gen OsMADS26 81
Hình 3.28. So sánh số nhánh tạo thành của dòng bất hoạt gen với cây ñối chứng 81
Hình 3.29. Thời gian ra hoa của các dòng lúa chuyển gen 82
Hình 3.30. Hình thái bộ rễ lúa sau thu hạt của các dòng lúa chuyển gen 83
Hình 3.31. So sánh cường ñộ quang hợp của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu
hiện và bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện gây hạn và ñối chứng. 84
Hình 3.31. So sánh cường ñộ quang hợp của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu
hiện và bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện gây hạn và ñối chứng. 85
Hình 3.32. So sánh hàm lượng diệp lục (Pi) của các dòng lúa chuyển gen gây siêu
biểu hiện và bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện gây hạn và ñối chứng. 86
Hình 3.33. Mô hình minh họa thí nghiệm southern blot 88
Hình 3.34. Sơ ñồ cắt enzyme giới hạn cho thí nghiệm southern blot 89

Việc xác ñịnh những gen chìa khóa tham gia vào quá trình phân nhánh bộ
rễ ở cây lúa có thể cho phép sử dụng các chỉ thị phân tử vào việc chọn lọc
những tính trạng cấu trúc bộ rễ lúa phù hợp với khả năng chịu hạn của lúa.
Mục tiêu của dự án là nghiên cứu chức năng của một số gen mã hóa một số
yếu tố phiên mã ở rễ lúa và vai trò của các yếu tố này trong sự hình thành
hình thái bộ rễ lúa. ðề tài phải giải quyết một loạt các vấn ñề kỹ thuật mới
trong ñó ñáng kể nhất là công nghệ RNAi. Công nghệ này lần ñầu tiên ñược
nghiên cứu ở nước ta.
Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

9
ðề tài “Nghiên cứu chức năng của các yếu tố phiên mã liên quan ñến
quá trình phân hoá của rễ lúa bằng các phương pháp gây siêu biểu hiện
gen và bất hoạt RNA (RNA interference)”, ñược thực hiện trên cơ sở hợp tác
khoa học với nhóm nghiên cứu “Phát triển và thích nghi của cây lúa”
(DAR) của UMR 1098 “Phát triển và thích nghi của thực vật” thuộc CIRAD
(Trung tâm quốc tế nghiên cứu phát triển nông nghiệp, Pháp). Mục tiêu của
ñề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn ñề sau: i) Xác ñịnh 1-2
gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc và chức năng bộ rễ ở
lúa; ii) Nghiên cứu thiết kế 1-2 vector mang gen siêu biểu hiện và mang gen
RNAi có khả năng gây bất hoạt gen của các yếu tố phiên mã nghiên cứu; iii)
Nghiên cứu quy trình chuyển các gen nghiên cứu vào lúa thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens; và iv) Phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen
bằng phương pháp sinh học phân tử và kiểu hình.
ðề tài ñã thực hiện ñầy ñủ các nội dung nghiên cứu và thu ñược những
kết quả chính như sau:
- Xác ñịnh các gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc và
chức năng của bộ rễ lúa: Xác ñịnh ñược bốn gen có liên quan ñến cấu
trúc và chức năng của bộ rễ lúa. ðó là: OsNAC2, OsMADS25,
OsMADS26 và OsMADS56.

FAO (năm 2005), 6-20% trong tổng sản lượng lương thực hàng năm của cả
thế giới (tương ñương với khoảng 120 tỉ USD) bị thất thoát do những tác nhân
phi sinh học như: hạn, lạnh, mặn, lũ lụt…ðối với các nước ñang phát triển,
hạn hán và sự suy thoái chất lượng ñất ñai ñã và ñang ảnh hưởng nghiêm
trọng tới sản lượng cây trồng. Chỉ tính riêng cho vùng nhiệt ñới, hàng năm ñã
có tới 20 triệu tấn lương thực bị mất mát do khô hạn gây ra. Ở Việt Nam, diện
tích canh tác lúa khoảng 4,36 triệu ha, trong ñó có 2,2 triệu ha là ñất thâm
canh, chủ ñộng tưới tiêu nước, còn lại hơn 2,1 triệu ha là ñất canh tác lúa có
những khó khăn: hạn, mặn, úng [31].
Nước thường xuyên ñược coi là nguồn năng lượng dồi dào ở những khu
vực có ñộ ẩm cao như ðông Nam Á trong ñó có Việt Nam, tuy nhiên nay ñã
trở thành một nhân tố hạn chế trong sản xuất nông nghiệp [14]. Trong những
năm vừa qua, hạn hán kéo dài xảy ra ở một số vùng thuộc ñồng bằng sông
Cửu Long và miền Trung Việt Nam làm giảm mực nước của các con sông
dẫn ñến việc nước biển tràn vào các kênh tưới tiêu, năng suất lúa trong những
khu vực bị hạn hán này ñã bị giảm từ 20 - 60%. Việc sản xuất lúa gạo ở ðông
Nam Á cũng như ở Việt Nam cần phải bắt kịp với sự bùng nổ dân số của khu